离子色谱^〔1〕、气相色谱^〔2〕、原子吸收等方法测定氟化物的成本高,所需时间长,难以普及。 氟离子选择电极法^〔3〕、分光光度法以操作简易、分析速度快被广泛应用。 但氟离子选择电极测定氟含量低于 0.06 μg /mL 样品时,毫伏值 E 与 logCF-不再呈能斯特响应^〔4〕,以至于痕量氟样品的测定结果偏差较大。 因此,建立一种简单快速,灵敏度高的痕量氟化物测定方法具有重要意义。 本研究采用酶标仪 - 氟试剂分光光度法,进行了痕量氟化物测定方法的研究,结果报告如下。

Sunrise Remote酶标仪 ( 丹麦 Sunrise 公司 ) 。 1.000 ,10.00 μg /mL氟标准液 (北京北化精细化学品有限责任公司 )。 0.02 mol/L氟试剂; 0.02 mol/L硝酸镧 ( 上海国药集团化学试剂有限公司 )。 3.5 mol/L pH 缓冲液,丙酮 -乙酰丙酮 (沈阳市试剂一厂 )。

标准曲线 I 制备: 分别取 1.000 μg /mL氟标准液 0.0、 5.0、 7.5、 10.0、 15.0、 20.0 μL于 96孔酶标板中,补去离子水至 200 μL,以微型振荡器混匀。 然后按每孔 70μL 丙酮、 20μL 乙酰丙酮、 20μL 氟试剂、 20μL缓冲液、 20μL硝酸镧的比例配制成混合试剂,一次性加入 150μL。 用酶标仪测定吸光度值 ( 波长 620或 630 nm ),建立标准曲线。 标准曲线II制备: 分别取 10.00μg /mL氟标准液 0.0、 2.5、 5.0、 7.5、 10.0、 12.5、 15.0、 17.5、 20.0μL于 96 孔酶标板中。 以后操作步骤同标准曲线I。 样品测定: 取待测样品 200μL置 96孔酶标板中,以后操作步骤同标准曲线制备。 氟含量 < 0.06μg /mL的样品以标准曲线I求得氟化物含量; 氟含量 > 0.06μg /mL的样品以标准曲线II求得氟化物含量。

氟试剂 - 镧 - 氟的络合物在水溶剂中不稳定,有机溶剂对其有稳定作用,以线性实验和检出限在丙酮、乙晴、丙酮 - 乙酰丙酮、乙晴 - 乙酰丙酮、丙酮 -乙晴 - 乙酰丙酮等 5种有机溶剂中选择稳定剂。

以 3水平 4因素正交设计对处理因素进行多因素分析,选择最佳条件。 A: 氟试剂和硝酸镧比例、用量 ( k₁:1 = 20：20μL; k₂:1.5= 16:24μL; k₃ 1:2 = 13:27μL ),处理因素 B: 稳定剂种类、用量 ( k₁丙酮 90μL; k₂ 丙酮 - 乙酰丙酮 70:20μL; k₃ 丙酮 - 乙晴 - 乙酰丙酮 50:20:20μL ),C是空列用作误差估计,处理因素 D: 缓冲液物质的量浓度 ( k₁3,k₂4,k₃6 mol/L) 。

进一步阐明不同物质的量浓度的缓冲液,对测定不同 pH 范围含氟样品实验结果的影响程度,取 pH 值范围 1.5 ~ 3.0、 4.0 ~ 10、 10 ~ 12.5含氟样品,用 3 ,4,6 mol/L缓冲液做了回收率比较实验。

选取含干扰离子 Al³⁺ 、 Fe³⁺、 Zn²⁺ 、 Pb²⁺ 、 CO³⁺ 、Ni²⁺ 、 SO₄^2- 、 Cl^- 分别为 0.8、 1.0、 0.6、 0.5、 0.5、0.5、 2.0、 2.5 mg /L及 1 /2浓度样品,用丙酮、丙酮 - 乙酰丙酮做抗干扰试剂,分 5个实验组: 未含干扰离子与丙酮 - 乙酰丙酮为I组; 含 1/2干扰离子与丙酮 - 乙酰丙酮为II组; 含 1 /2干扰离子与丙酮为III组; 含干扰离子与丙酮 - 乙酰丙酮为IV组; 含干扰离子与丙酮为V组,进行抗干扰实验。

精密度、准确度实验: 据标准曲线范围选择低、中、高 3个剂量水平的含氟样品,进行重现性和加标回收率实验。 精度 ( 线性 ) 实验: 取低剂量氟标准 0.003、 0.004、 0.005、 0.006、 0.008、 0.01μg做线性实验,检测方法的精度,给出检出限。

采用 SPSS 11.0软件进行数据处理 ,采用多因素分析 (相关系数检验 )进行组间比较,检验水准α= 0.05。

以丙酮、乙晴、丙酮 - 乙酰丙酮、丙酮 -乙晴 -乙酰丙酮为稳定剂的标准曲线,有良好的线性关系和较低的检出限,两两相关系数差别显著性检验,差异无统计学意义 (P > 0.05),均可作为本方法的稳定剂。 乙晴-乙酰丙酮不适合作本方法的稳定剂。

表 1

表 1 不同种类有机溶剂线性实验相关系数和检出限 ( n = 6)

表 1 不同种类有机溶剂线性实验相关系数和检出限 ( n = 6)

处理因素 A、B、D是主要因子,最佳提取条件为 A₁B₂D₂ 或 A₁B₁D₁。 即氟试剂与硝酸镧比例为 1:1 ; 稳定剂为丙酮 - 乙酰丙酮或丙酮; 缓冲液摩尔浓度 4或 3 mol/L。

表 2

表 2 各种试剂浓度比例用量 L9 ( 34 )实验结果

表 2 各种试剂浓度比例用量 L9 ( 34 )实验结果

当样品 pH 值为 1.5 ~ 10.0 时,使用 3 mol/L缓冲液,回收率为 96.09% ~ 101.21% ,样品 pH 值范围 4.0 ~ 12.5时,使用 4 mol/L缓冲液,回收率为 96.71 % ~ 101.98% 。 而使用 6 mo l/L缓冲液时回收率均较低。

实验I、II、III组回收率分别为 100.11% ,99.66% ,97.70% ,其氟含量测定结果多变量方差分析,差异无统计学意义 (P > 0.05)。 表明含 1 /2干扰离子对实验影响可忽略。IV、V组回收率分别为 94.73% ,87.14% ,5组多变量方差分析 F = 1703.362 ,差异有统计学意义 ( P < 0.000 1)。 表明当干扰离子含量较高对实验产生影响时,丙酮 - 乙酰丙酮显示出抗干扰离子的作用。

低、中、高 3个氟水平样品实验的变异系数 < 2.65 % ,加标回收率在 99.90% ~ 100.23% 。 显示了良好的精密度和准确度。 精度 ( 线性 ) 实验相关系数r为 0.998 9,显示出良好的线性关系。 检出限可达 0.001μg。

表 3

表 3 不同氟水平样品重现性和加标回收率 ( n = 6)

表 3 不同氟水平样品重现性和加标回收率 ( n = 6)

本研究采用多层次实验对稳定剂种类进行筛选,不仅考虑到氟试剂 - 镧 - 氟络合物稳定性,还探讨了线性关系、检出限、试剂浓度、比例、用量以及抗干扰离子等问题,筛选出了具有良好线性关系、高灵敏度和较强抗干扰离子能力的稳定剂 (丙酮 -乙酰丙酮 )。 本方法检测样品多为经强酸、强碱处理的消化液,其 pH 值范围较宽,而氟试剂 - 镧 - 氟络合物颜色,在不同 pH 值范围内显色不同,故本研究使用不同浓度缓冲液,检测了不同 pH 范围的含氟样品,结果显示,缓冲溶液缓冲能力不仅与共轭酸离解常数 PK a以及缓冲比有关 ,而且与缓冲液的总浓度相关,本方法给出的最佳缓冲液浓度为 3.5 mol/L。 本实验变异系数 < 2.65% ,回收率为 99.90% ~ 100.23% ,灵敏度为 0.003μg,检测限达 0.001μg,表明本方法具有较高的准确度和精密度。 因此,酶标仪 - 氟试剂法是一种简单快速、经济实用,灵敏度、准确度较高的痕量氟化物测定方法。