睾丸外因素是引起男性不育的主要原因,生活环境及方式等是造成男性不育的重要原因 ^{〔1, 2〕},而高温是导致男性生殖损伤的主要物理危险因素之一。山茱萸是中国传统名贵中药材和滋补食品,具有补肝肾、涩精气、固虚脱功效,是治疗男性病的良药。山茱萸多糖( FCP )是山茱萸的主要生物活性物质,已证明具有免疫调节、降血糖、抗衰老及抗氧化作用 ^{〔3, 4, 5〕}。 本研究通过温水浴建立雄性大鼠睾丸损伤模型,观察 FCP 对高温造成的大鼠睾丸组织损伤的影响,为 FC P 在生殖保健领域的应用提供参考依据。

山茱萸 (香港坚尼地城中草药市场 ),丙酮 ( 上海试剂四厂昆山分厂 ),乙醇 ( 武汉市江北化学试剂厂 ) ,戊巴比妥钠、多聚甲醛 (美国 Sigma 公司 ),超氧化物歧化酶 ( SOD )、丙二醛 (M DA )试剂盒 RNA 酶 ( 南京建成生物工程研究所); AG 204型精密电子分析天平 ( 上海梅特勒 • 托利多仪器公司 )、ZK-82B 型真空干燥箱 ( 上海市实验仪器总厂 ) ,FAC Sort流式细胞仪 (美国 Becton Dickinson公司 )。

SPF 级 SD 大鼠 ( 武汉大学实验动物中心 )36只,雄性,体重 ( 200 ± 20) g。适应性饲养数天,按 12 h节律调节光照,保持饲养环境的适宜温度和相对湿度,自由饮水,普通饲料喂养。

将干燥山茱萸粉碎,过筛,用 8 ~ 10 倍体积的 95% 乙醇回流 8h 脱脂,滤渣风干,再以 80% 乙醇 300 mL 回流 2次脱低聚糖,每次 4 h,温度 80 e 。加蒸馏水,残渣 80 e 下搅拌 2 h后,过滤、离心重复 4次,提取浓缩液。加入 1/5倍体积的氯仿和 1 /25倍体积的正丁醇,振荡 10 min,以4 000 r /m in离心 10 m in,分离收集脱蛋白浓缩液。加入 4倍体积的 95% 乙醇醇沉,离心,去上清液,沉淀物依次用无水乙醇、 丙酮、乙醚洗涤,冷冻干燥,得到浅褐色山茱萸多糖。

实验分为正常对照、损伤对照、4个 FCP 剂量组,每组 6只。生理盐水稀释 FCP 为 1 g /L,每天分别按 10,50,100,150 mg /kg 灌胃; 正常及损伤对照组灌胃等体积生理盐水,连续 14 d。第 15 d 除正常对照组外,其余各组大鼠均于用 3% 戊巴比妥钠麻醉,将四肢绑于立式支架,使阴囊浸没于 43 e 温水中 15 m in,建立大鼠生殖系统损伤模型。造模 24h后,称体重,股动脉放血,处死动物 。

10% 多聚甲醛溶液固定睾丸组织 24 h,石蜡切片,苏木素 - 伊红 (H E)染色,显微镜下观察。

分离一侧睾丸和附睾组织表面的脂肪,称重,按 (睾丸重量 / 动物体重 ) × 1 000 计算脏器系数,单位 g /kg。

利用血细胞计数板,200 倍显微镜下计数精子数。另取一滴涂片,观察精子活率,精子活率 = 活动精子数 / (活动精子数 + 不活动精子数 ) × 100% 。

用生理盐水在冰浴条件下制成 10% 睾丸组织匀浆,离心后取上清液。用 lowry法平行测定样品中蛋白质含量,按试剂盒操作说明进行。 SOD 活力单位定义:以每毫克组织蛋白在 1mL 反应液中 SOD 抑制率达 50% 时所对应的 SOD 量为一个亚硝酸盐单位,单位为 NU / mg prot。 MDA 测定按试剂盒操作说明进行,单位为 nm ol/m g prot。

用磷酸盐缓冲液( PBS)制成单细胞悬液,加入预冷的 70% 乙醇固定,离心去除固定液,加 PBS适量重悬 5 m in,离心,弃去 PBS液,加入 RNA 消化酶,过滤,加入 50 mg /L 碘化丙啶染液 ,于 4 e 避光保存 1h。在流式细胞计上测定,计算各期细胞数量占总细胞的百分率及凋亡率。

采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析。所有数据均以 x±s表示,显著性检验用方差分析。

镜下观察,正常对照组生精小管横切面可见精原细胞及不同发育阶段的精母细胞、精子细胞、精子, 组成多种形态的生精上皮图像。而损伤对照组曲细精管变薄, 各级生精细胞明显减少, 精子细胞及精子消失, 部分曲细精管内仅剩支持细胞及少量精原细胞。 FCP各实验组对睾丸组织结构的损伤有一定保护作用, 随着浓度的增加保护作用明显, FCP 150 mg /kg组, 睾丸组织形态结构规则, 生精小管界膜较完整, 各级生精细胞排列有序, 初级精母细胞、精子细胞数量增多结构良好。

1)损伤对照组大鼠睾丸、附睾脏器系数、精子计数及活力比正常对照组明显减低,差异有统计学意义 (P < 0.05或 P < 0.01); FCP 剂量组能明显提高睾丸、附睾的脏器系数,改善精子数量及活力,其中 FCP 150 mg /kg 剂量组效果最佳,与损伤对照组比较差异有统计学意义 (P < 01 05或 P < 0.01)。

表 1

表 1 FCP 对高温损伤大鼠生殖腺、精子数量和精子活力的影响 ( x±s ,n = 6 )

表 1 FCP 对高温损伤大鼠生殖腺、精子数量和精子活力的影响 ( x±s ,n = 6 )

损伤对照组与正常对照组比较,睾丸组织中 SOD 活性下降,M DA 含量上升,差异有统计学意义 (P < 0.01); FCP能提高大鼠睾丸组织中 SOD 活性,降低 MDA 含量,除 FCP 10 m g组其余 FCP 各组与损伤对照组比较,差异有统计学意义 (P < 0.01 或 P < 0.05) 。

表 2

表 2 FCP 对高温损伤大鼠生殖腺、精子数量和 精子活力的影响( x±s , n = 6 )

表 2 FCP 对高温损伤大鼠生殖腺、精子数量和 精子活力的影响( x±s , n = 6 )

损伤对照组的 G0 /G1期细胞数量明显高于正常对照组,说明高温使细胞生长阻滞在G0 /G1期。 FCP 实验各组与损伤对照组比较,S 和 G2 /M 期的细胞明显增多,而 G0 /G1期细胞数目减少,差异有统计学意义 ( P < 0.01或 P < 0.05),即 FCP 有效调节了生殖细胞的生长周期,促进生殖细胞的正常生长。

表 3

表 3 流式细胞术检测 FCP对生殖细胞周期分布的影响 ( x±s ,n = 6 )

表 3 FCP对生殖细胞周期分布的影响 ( x±s ,n = 6 )

睾丸是具有高度增殖能力的组织,其生精过程需要适宜的内外环境,任何改变均可能导致生殖功能异常,造成不育。 Lue 等 ^〔7〕利用温水浴造成生殖损伤模型 ( 43 ℃ ,15 min) ,观察到热处理与正常对照组比较,睾丸重量和精子计数均明显下降。许多等 ^〔8〕通过对大鼠睾丸局部热暴露 ( 43 ℃ 水浴 30 min) 研究证实高温作用后能引起大鼠睾丸生精上皮可复性损伤而导致生精障碍。本实验也同样得到高温使雄性大鼠睾丸的生殖腺组织萎缩,生精环境发生改变,阻碍了精子的发生和发育。山茱萸是中国传统的补肾壮阳的名贵中药材,蒋淑君等 ^〔9〕发现山茱萸提取物使肾阳虚大鼠下丘脑钙调蛋白( CaM ) mRNA 的表达量减少,促肾上腺皮质激素释放激素 ( CRH )分泌增多,具有较显著的补益肾阳功效。邵祥龙等发现山茱萸多糖可改善半去势大鼠性功能。

本研究发现,FCP各组对保护睾丸损伤组织的形态结构有一定作用,并随着浓度增加保护作用明显。同时还发现 FCP各剂量组对高温损伤睾丸组织能明显提高睾丸、附睾的脏器系数、促进精子发生和提高精子活力,对高温引起的生殖细胞损伤有抗氧化、调节细胞周期、抑制凋亡作用。表明 FCP 对高温造成睾丸组织损伤有保护作用,且以 FCP150 mg /kg 剂量为佳,呈剂量反应关系。 对于其保护机制,可能是 FCP 的抗氧化、抑制细胞凋亡功能,也可能是中枢性调节作用 ^〔10〕,仍需进一步研究证明。