低水平的慢性铅暴露对婴幼儿脑中枢神经系统不可逆的损害以及对学习记忆能力的影响是一个备受关注的问题。海马是铅脑损害的主要靶区,是大脑学习和记忆的关键部位^〔1〕。海马长时程增强( long term potentiation,LTP) 由于本身具有协同性、联合性、特异性等特点,使它成为信息储存和记忆的细胞机制^〔2〕。本研究通过检测铅对原代培养海马神经细胞的细胞周期阻断情况与细胞周期蛋白cyclinD1表达的相关性,进一步探讨铅的神经毒理作用机制。

新生 1~ 2d的 Wistar大鼠 (中国医科大学实验动物中心 ) 10只,雌雄不限,用于提取原代海马神经细胞。 原代海马神经细胞的培养方法按参考文献 ^〔3〕进行。

Dulbecco改良 Eagle培养基 ( DM EM / F12)、神经细胞培养基、无血清培养基添加因子 (美国 Gibco 公司 ) ; L-谷氨酰胺、盘尼西林,多聚赖氨酸、胰蛋白酶 ( 美国 Sigma公司 ); 阿糖胞苷 ( 美国 Pharmacia 公司 ); 胎牛血清 ( 美国 Santa Cruz公司 ); 其他试剂均为国产分析纯。流式细胞仪 ( 美国 Becton Dickinson公司 ) 。

原代培养的海马神经细胞 ,于培养 7 d全量更换培养液后分别加入含有不同浓度的醋酸铅 ( 0.2,1.0 和 10 μmol/L )。置于 370 ℃ 、5% CO₂ 培养箱继续培养 12 h,0. 125% 胰蛋白酶消化并收集细胞,预冷磷酸盐缓冲液 ( PBS) 调整细胞密度,超声波破碎细胞 30 s,40 ℃ ,2 000 r /m in离心,10 m in,收集上清液进行相关指标检测 。

将收集到的细胞,用预冷 PBS洗涤 2次,离心后弃上清,加入 70% 冷乙醇,4 ℃ 固定 > 18 h。 800 g 离心弃上清,PBS洗 1次,离心弃上清 ,1 000 μL PBS重悬,加 RNase( 100μg /mL 的 10 mmol/L tris-HCL 溶液,pH 7.5) 100 μL,混匀,37 ℃ 水浴 30 min,800 g 离心弃上清,PBS洗 1次,离心弃上清,洗去 RNase后,加入 500μL 碘 化丙啶(PI) (50 μg/mL的3.8 × 10^-2 mol/L柠檬酸钠溶液, pH 7.0), 4 ℃ 避光染色> 1 h。流式细胞仪测定荧光强度检测DNA含量, 激发波长488 nm。用Ce ll-Quest软件进行细胞周期DNA含量分析。

考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。上样总蛋白 30μ g,10% 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE )分离蛋白质,电转移至硝酸纤维素膜,根据分子量裁膜。 5 % 脱脂奶粉室温封闭 1 h; CyclinD1一抗 ( 1: 400)在 4℃ 孵育过夜; 与辣根过氧化物酶标记二抗 ( 1: 5000)室温孵育 1 h,每次孵育后均用含 5 % Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水 ( TBS )洗脱 3 次,每次 5 m in。 最后底物化学发光 ( electro chemilumines conce,ECL )试剂显带,X 光片曝光,显影、定影。将蛋白印迹显影图扫描,再利用 Chemi Imager 5500 V2103图像分析软件对实验结果进行分析,灰度值代表酶含量。

随着染铅浓度 0.2,1.0 和 10 μmol/L 的增加,CyclinD 1蛋白表达与对照组比较,逐渐降低 ( P < 0.05)。

图 1

图 1 醋酸铅对原代海马神经细胞 CyclinD1蛋白表达影响

随着染铅浓度增加,可观察到细胞阻断情况发生。在原代培养的海马神经细胞 S 相过程中尤为明显。当原代培养海马细胞染铅浓度为 0.2 μmol/L 时,细胞周期阻断情况不明显,当染铅浓度增加到 1.0、10 μmol/L 时,S和 sub-G1 期细胞周期阻断情况明显。

表 1

表 1 铅对海马神经细胞细胞周期进程的影响 ( x±s ,% )

表 1 铅对海马神经细胞细胞周期进程的影响 ( x±s ,% )

研究发现,cyclinD1在 G1期的蓄积依靠持续的促有丝分裂刺激。生长因子减少阻止 cyclinD1 的基因表达,相关的不稳定蛋白能确保 cyclinD 1水平大幅度下降,因此缺少促有丝分裂素的细胞能迅速退出细胞周期 ^{〔4, 5〕}。 有研究显示,激活的未折叠蛋白反应不能最终有效的诱导保持细胞周期进程的其它必需蛋白的表达下降 ^〔6〕。 CyclinD1的合成对转录减少尤为敏感,因此可作为快速影响细胞周期机制的极好靶点。 cyc linD 1的合成是一个 G1期进程特定的有限制性的调节子。事实上,cyclinD1蛋白表达下降使得细胞周期进程短路 ,也就是细胞周期进程停滞在 G1 期。 铅引起的细胞损伤机制与cyclinD1和细胞周期进程存在一定关联。本研究结果显示,进入海马神经细胞的铅能造成细胞周期进程停滞,与此同时细胞周期蛋白 CyclinD1的表达明显下降, 进一步证明了海马神经细胞是铅神经毒性作用中的一个重要靶点。