急性出血性结膜炎 ( acute hem orrhagic conjunctivitis,AHC ),又称流行性出血性结膜炎,俗称 "红眼病"。其主要病原体为微小核糖核酸病毒科中的肠道病毒 70型 ( enterovirus 70,EV 70)和柯萨奇病毒 A24变异株 ( cox sa ckie virus A 24 va-riant,CA24v ) 。 2002年8月浙江省宁波和杭州地区曾发生由 CA24v引起的 AHC 流行。 2007 -2008 年浙江省 AHC 病例报告数居全国前几位 ^〔1〕,浙江省宁波和海盐等地相继发生 AHC 流行。为了迅速查明病因,及时采取有效的控制措施,对 23例AHC 患者的临床标本进行实验室应急诊断,并对分离株进行分子特征分析。

浙江省法定传染病疫情报告系统和浙江省各级疾病预防控制中心传染病暴发疫情流行病学调查结案报告。选择2007-2008 年各级疾病预防控制中心送检的发病 1~ 3 d 内临床诊断急性出血性结膜炎 (AHC) 爆发疫情患者 23例,采集眼拭子标本 23份。

(1)仪器与试剂 : Hep-2细胞( 中国疾病预防控制中心病毒病所诊断室 ),RN easy mini Kit(德国QIAGEN 公司 ),one Step RNA PCR Kit( 大连宝生物工程有限公司 ),M J Research Opticon荧光定量系统 ( 美国 M J公司 )。 (2)用灭菌棉拭子轻轻涂擦患者眼结膜,将涂擦后的棉拭子置含有 2~3 mL灭菌 m inim um essen tia lm ed ium (M EM )培养液的采样管内,置冰壶内送实验室,-70℃ 低温冰箱保存。

病毒分离按照卫生部标准 W S217-2008《急性出血性结膜炎诊断标准及处理原则》^〔2〕进行。 显微镜下观察细胞病变 ( CPE ) 至第 7 d,当出现 CPE 至 ≥ 75% 时收获,进一步作病毒鉴定; 如无细胞病变继续盲传,盲传 2代仍无 CPE判为病毒分离阴性。 病毒鉴定采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应 ( RT-PCR ) 法和 V P1 基因测序,G enBank进行 BLAST 比对。

取标本 200 μL 或病毒分离阳性物 100 μL,采用 RN easy mini Kit提取病毒 RNA,操作按照试剂盒说明书进行,最终收集 RNA 提取液 30 μL。

采用肠道病毒 Taq Man荧光定量 RT-PCR 方法,参照文献 ^{〔3, 4〕}进行。

自行设计 VP1 基因引物,VP1-F2: 5-CATCTGGTACACCAA CGTC-3,VP1-R 2: 5-CACTC-CTGCTCTACAACTAC-3,扩增片段为 1 222 bp; 3C 区引物参照文献 ^〔5〕,D 1: 5'-TAC AAA CTG TTT GCT GGG CA-3' ,U2: 5'-ACT TCT TTT GAT GGT CTC AT -3'了,扩增片段为 674 bp。引物由上海英骏生物科技有限公司合成。片段扩增采用 RT-PCR 方法,按试剂盒说明书进行。反应体系: 10 x RNA PCR 缓冲液 ( RNA PCR Buffer) 5 μL、MgCl₂ ( 25 mmo l/L ) 10 μL、dNTP 混合液 ( dNTPmix ) ( 各 10 mmol/L ) 5 μL、RNA 酶抑制剂 ( RN ase Inhibitor) ( 40U /μ L) 1 μL、AM V 逆转录酶 ( AMV RT ase) ( 5U / μL ) 1 μL、Taq( 5U /μL ) 1 μ L、上游和下游特异性引物 ( 20 μmo l/L ) 各 < /span>1 μ L、RNA 提取液 8 μL,无 RNA 酶水补足到 50 μL。反应条件为: 50 ℃ 30 m in逆转录,95 ℃ 2 m in后,94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1. 5 m in,循环 40次,72 ℃ 延伸 8 m in,然后转入 4 ℃ 。取扩增产物 5 μL,用 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳,根据 M arker位置确认扩增产物。

采用 PCR 扩增产物纯化后直接测序,委托上海英骏生物科技有限公司完成测序工作。数据处理采用 DNAM AN、M EGA4.1 软件进行同源性和进化分析。

23份眼拭子标本中,检出 EV 和CA24v 核酸阳性 17份,阳性率为 73. 9% 。

Figure1">图1

图1 肠道病毒 TaqM an荧光定量 RT-PCR法对眼拭子样本进行 CA24v核酸检测

采用 Hep-2细胞进行病毒分离,标本接种细胞后,细胞出现散在性变圆、缩小,细胞膜增厚,折光度下降等病变特点。型别鉴定结果显示,眼拭子样本 23份中,分离到 15株CA24v,病毒分离率为 65. 2% 。

随机抽取 CA24v 分离株 3 株,对 VP 1基因全长测序,扩增片段为 1 222 bp,测序获得 V P1全长 915个核苷酸 ( nt) ,3C 区扩增片段为 674 bp,获得 549个核苷酸 ( nt); VP1和 3C 区均未发现核苷酸的插入和丢失 。浙江分离株 Zhejiang /13/08与 CA 2 4v原型株 EH 24 / 70 在 VP1和 3C 区核苷酸同源性分别为 85. 3% 和 86.5% ,与 2005年新加坡分离株 Singapo re /DSO-26 /05和 2007年广东分离株 G uangdong /332 /07株在 VP1区和 3C区的核苷酸同源性分别为 97.0% ~ 99. 1% 和 96.7% ~ 99. 5% 。

表 1

表 1 浙江CA24v分离株与国内外毒株核苷酸同源性比较

表 1 浙江CA24v分离株与国内外毒株核苷酸同源性比较

随机抽取 3株浙江 CA24v 分离株进行 V P1基因和 3C 区测序,并与 GenBank 下载的不同时期、不同国家 CA24v毒株在该区域核苷酸序列,采用 MEGA 软件和相邻连接法 ( neighbor joining N J) 构建进化树。进化树显示,2007~ 2008年浙江分离株在 3C 区的 GI B 分支上,在 VP1区 Group2分支上。

本研究从 2007-2008年浙江省急性出血性结膜炎爆发流行的患者23份眼拭子标本中,检出 EV 和 CA24v 核酸阳性 17份,分离到 CA24v病毒 15株。采用直接提取病毒 RNA,使用荧光 RT-PCR 方法检测 EV 和 CA24v核酸,从核酸提取到报告结果基本在 4 h左右完成,为及时采取针对性防控措施提供了可靠的实验室依据,并证实引起 2007-2008年浙江省急性出血性结膜炎爆发流行的病原为 CA24v,与 2007年广东分离株 G uangdong /332/07 在 V P1区和 3C 区的 nt同源性分别 99. 1% 和 99. 5% ,属于同一类性质的病原。进化树分析结果可见,3株浙江分离株在进化树的 Ⅱ 基因亚型 B分支上 ( G Ⅱ /B),与国内广东、新加坡和朝鲜等国家 2002-2007年分离株均在同一进化支上,表明浙江流行株与在 2000年以后各地流行的 CA24v 毒株具有共同的基因进化关系,浙江 CA24v 毒株最有可能来源于新加坡 ^〔5,6〕。

AHC具有高度接触传染性,通过直接接触带有病毒的结膜、呼吸道排泄物以及粪便或接触污染的水或物品而感染。 本病可同流感一样迅速传播,在 1~ 2个月内可使人群患病率达 50% ,拥挤和不卫生的条件下传播更快,家庭内传播也很普遍。因此,一旦发生较大疫情,易造成学校停课,幼儿园放假等现象,影响居民的正常生活和工作,因此,必须密切关注 AHC 传染病报告,发现疫情及时进行实验室确诊和病原学监测,为采取有效的防控措施提供科学依据。