中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (2): 212-213   PDF    
引用本文
金明华, 刘晓梅, 郝民, 王华, 王雯, 徐艳玲, 孙志伟. 苯并(a)芘对雄性小鼠生殖细胞毒性作用[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(2): 212-213.
JIN Ming-hua, LIU Xiao-mei, HAO Min, et al. Effect of B(a)P on germ cells of male mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(2): 212-213.
苯并(a)芘对雄性小鼠生殖细胞毒性作用
金明华1, 刘晓梅1, 郝民1, 王华1, 王雯1, 徐艳玲1, 孙志伟1,2     
1. 吉林大学公共卫生学院, 吉林 长春 130021;
2. 首都医科大学公共卫生学院
数字出版日期: 2010-06-02.
基金项目: 教育部骨干教师振兴计划项目
作者简介: 金明华(1966- ),女,朝鲜族,副教授,博士,主要从事环境有害因子生物效应及其作用机制研究.
通讯联系人: 孙志伟,E-mail:zwsun@hotmail.com
摘要: 目的 研究不同剂量苯并(a)芘对小鼠睾丸细胞酶活性、精子畸变率及生殖细胞DNA损伤影响。方法 采用分光光度法测定小鼠睾丸细胞乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)和山梨醇脱氢酶(SDH)活性;利用单细胞凝胶电泳检测苯并(a)芘对生殖细胞DNA作用;采用精子畸变和微核试验方法检测精子畸变率和精细胞微核率。结果 随着染毒剂量增加,LDH活性逐渐降低,20 mg/kg苯并(a)芘组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);不同剂量苯并(a)芘均可造成小鼠生殖细胞DNA损伤,5,10,20 mg/kg的损伤率分别为44%,79%和88%,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),精子畸变率和精细胞微核率分别为1.10%,2.24%,3.64%和11.00%,14.40%,17.40%;与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 一定剂量条件下,苯并(a)芘能够影响小鼠睾丸细胞酶活性,导致小鼠生殖细胞DNA损伤,并在一定剂量范围内对雄性小鼠的生殖细胞产生毒作用。
关键词: 苯并(a)芘     生殖细胞DNA损伤     乳酸脱氢酶     山梨醇脱氢酶     葡萄糖-6-磷酸脱氢酶    
Effect of B(a)P on germ cells of male mice
JIN Ming-hua, LIU Xiao-mei, HAO Min, et al    
School of Public Health, Jilin University Changchun 130021, China
Abstract: Objective To study different concentrateions of B (a) Pon enzyme activitiy,spermabnormality rate,and DNA damage rate of mouse germ cells.Methods Lactate dehydrogenase (LDH),glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PD),sorbitol dehydrogenase (SDH) were measured with spectrophotometry; DNA damage was detected with single cellgel electrophoresis(SCGE),and sperm abnormality rate and sperm cells micronucleus rate were determined with sperm aberration test and micronucleus test,respectively.Results B (a) P affected activities of LDH,SDH,G-6-PD in mouse testicular cells.The activities of LDH in testicular cells decreased with the increasing of B (a) P exposure dose,and significant defference was observed between 20 mg/kg group and the negative control group(P < 0.05).DNA damage was observed in every exposure group,with the damage rate of 44%,79%,and 88%,respectively,and all of the rate were significantly different from that of negative control group(P < 0.05).Sperm abnormality rate and sperm cellmicronucleus rate in each exposure group were 1.10%,2.24%,3.64%,and 11.00%,14.40%,17.40%,respectively,and were significantly different from that of the control group(P < 0.05).Conclusion B (a) P could influence enzyme activities of mouse sperm cell,cause DNA damage and have cytotoxicity to male mouse sperm cell within a certain dose range.
Key words: benzo(a) py rene(B(a) P)     germ cell DNA damage     LDH     SDH     G-6-PD    

苯并 (a)芘 〔benzo (a) pyrene,B (a ) p〕是一种广泛存在于环境中的具有致癌作用的多环芳烃类化合物 (1)。人群流行病学调查显示,B (a) P 与人类癌症关系密切,其毒性作用与其化学结构以及代谢产物有关 (2J。国内外许多学者对其毒性进行了研究,但对于生殖系统毒性研究较少。研究证实,苯并 (a)芘对小鼠精子的形成有损害作用,是生殖细胞潜在诱变剂 (3J,生殖毒性和遗传毒性的研究已成为苯并 (a) 芘毒性研究的重要内容之一。本研究通过体内给予小鼠不同剂量苯并(a)芘,观察其对睾丸相关酶类及其生殖细胞 DN A 损伤影响。

1 材料与方法 1.1 实验动物与分组

健康昆明种小白鼠 (吉林大学实验动物中心 ) 30只,雄性,体重 (28 ± 2) g。随机分为阴性对照组 (玉米油 )、5、10、20 mg /kg 苯并 (a) 芘染毒组和阳性对照组即环磷酰胺100 m g /kg,每组 6只。

1.2 试剂与仪器

苯并 (a) 芘 (德国 M erck 公司 ); 山梨醇(上海化学试剂采购供应站 ); 葡萄糖 - 6- 磷酸二钾盐 (中国科学院生物化学研究所 ); 磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 (沈阳市试剂三厂 ); 肌氨酸钠 (美国 Sigma公司 ); 曲拉通 - X 100(上海化学试剂厂 ); 721型分光光度计 (上海第二分析仪器厂 ); 台式离心机 (北京医疗仪器厂 )。

1.3 染毒方式

小鼠在灌胃前后禁食 3 h,阴性对照组 (玉米油 ),5,10,20 m g /kg 苯并 (a )芘染毒组口腔灌胃给药,连续 3 d。阳性对照组腹腔注射 1次给药。于染毒结束后 24 h 脱颈椎处死,取睾丸,称重,剥去被膜,在冰浴下匀浆,4 ℃ 12 000 r /m in离心 15 m in,取上清待测。

1.4 指标检测 1.4.1 睾丸细胞酶活性测定

乳酸脱氢酶 (LDH )、葡萄糖 -

6- 磷酸脱氢酶 (G-6-PD )和山梨醇脱氢酶 (SDH ) 采用分光光度法测定 (4J。乳酸脱氢酶转换数定义: 在 25 C 每分钟每 135 000 g酶蛋白 (1 m ol/L LDH )所形成的还原型辅酶 1 (NADH ) 的摩尔数。考马斯亮兰法测定蛋白质含量 〔5〕。

1.4.2 睾丸

细胞 DNA 损伤检测采用 Singh方法 〔6J,溴化乙啶 (EB) 染色后,荧光显微镜下观察细胞,每组随机拍摄 200个细胞记录损伤情况。根据 DNA 损伤程度分为 5级。

DNA 损伤率 = (各级细胞数 /计数细胞总数 ) x 100% 。

1.4.3 小鼠精子畸变试验 〔7〕

染毒后 24 h将小鼠脱颈椎处死,剖开腹腔,取出睾丸,分离两侧附睾,用生理盐水冲洗精子涂片。用甲醇固定 5 m in。 2% 伊红溶液染色 1 h。 在高倍镜下检查精子形态。每只小鼠检查完整精子 500 条,每一剂量组检查 2 500条精子。

1.4.4 生精细胞微核实验

取一侧睾丸,放于载玻片上,剥除睾丸被膜,用剪刀将曲细精管剪碎,2.2% 柠檬酸钠溶液制备细胞悬液,涂片。将玻片于甲醇固定 10 m in,自然干燥,用 G iem sa染液 (pH 6. 8)染色 30 m in,自来水冲洗,干燥后在油镜下计数早期精细胞微核率。

1.5 统计分析

采用 SAS软件的 χ2 和 t检验方法进行统计分析,检验水准 α= 0. 05。

2 结果 2.1 苯并 (a)芘对小鼠睾丸细胞酶活性影响 (表1)

染毒各剂量组 LDH、G-6-PD、SDH 活性随着染毒剂量增加而逐渐降低,其中苯并 (a) 芘 20 m g /kg剂量组、阳性对照组的 LDH 活性与阴性对照组比较差异有统计学意义; G -6-PD、SDH 活性各剂量组与对照组比较差异无统计学意义。

表 1 苯并(a)芘对雄性小鼠睾丸细胞酶活性影响(x±s , n= 6)
2.2 苯并 (a)芘对小鼠精原细胞 DNA 影响 (表2)

体内给予小鼠不同剂量苯并 (a) 芘均可以导致小鼠精原细胞 DNA 损伤。随着苯并 (a )芘染毒剂量增加,各剂量染毒组与阴性对照组比较差异有统计学意义 (P < 0. 05),细胞 DNA 损伤程度与染毒剂量存在剂量 - 效应关系。

表 2 B(a) P 对小鼠睾丸细胞DNA 损伤影响(n= 6)
2.3 苯并 (a)芘对小鼠精子畸变率影响

精子畸形试验结果表明,苯并 (a) 可致精子畸形率升高,阴性对照组,5、10、 20 mg /kg苯并 (a) 芘组和环磷酰胺组的畸形率分别为 0. 82% 、1. 10% 、2. 24% 、3. 64% 和 4.0% 。 随着染毒剂量增加,精子畸变率逐渐升高,10、20 m g /kg 苯并 (a) 芘组与阴性对照组比较差异有统计学意义 (P < 0. 05)。

2.4 苯并 (a)芘对小鼠精细胞微核影响

早期精细胞微核试验结果表明,苯并 (a) 芘可致早期精细胞微核率升高。阴性对照组,5、10、20 m g /kg 苯并 (a )芘组和环磷酰胺组的微核率分别为 6. 2% 、11. 0% 、14.4% 、17.4% 和 25. 8% ,随着染毒剂量增加,精细胞微核率逐渐升高,各剂量染毒组与阴性对照组比较差异有统计学意义 (P < 0. 05)。

3 讨论

生殖系统对化学毒物的作用非常敏感,较早出现功能甚至结构改变。 LDH 催化丙酮酸脱氢而转变成乳酸,参与能量代谢,LDH 的活性受到抑制,将阻碍能量的供给 〔8〕。因此,能量供给阻碍可能引起 DNA 合成受到抑制。 LDH 、SDH、G-6-PD 参与能量代谢和类固醇激素合成 〔4〕。实验结果表明,苯并 (a) 芘可使 LDH 活性受到明显抑制,阻碍能量供给,苯并 (a) 芘对 SDH、G-6-PD 活性作用并不明显。苯并 (a) 芘还可以引起雄性小鼠睾丸细胞 DNA 损伤,导致精子畸形率和微核率增加。苯并 (a)芘可以影响小鼠睾丸细胞周期进程,使睾丸细胞 DNA 合成受到明显抑制,睾丸生殖细胞阻滞于 G2 期,使细胞有丝分裂延迟 〔9〕,提示苯并 (a) 芘可引起睾丸细胞 DNA 损伤和精细胞微核,也能够通过血 - 睾屏障直接作用于精子,使精子发生畸变,影响雄性小鼠生精过程。

本研究显示,不同剂量苯并 (a) 芘均可导致细胞 DNA 损伤,可能是由于苯并 (a)芘可透过血 - 睾屏障,与核酸分子共价结合,导致 DNA 损伤。提示一定剂量的苯并 (a) 芘可以影响睾丸细胞酶活性,导致DNA 损伤,可能是引起生殖毒性重 要途径之一。

参考文献
〔1〕 Smith TL,Merry ST,Harris DL,et al.Species-specific testicular and hepaticm icrosomalm etabolism of benzo(a) pyrene,an ubiquitous toxicant and endocrine disruptor[J].Toxicol In Vitro,2007,21 (4):753-758.
〔2〕 Hengstler JG,Vander Burg B,Steinberg P,et al.Interspecies differences in cancer susceptibility and toxicity [J].Drug Metab Rev,1999,31 (4):917-970.
〔3〕 Verhofstad N,vanO ostrom CT,van Ben them J,et al. DNA adduct kinetics in reproductivet issues of DNA repair proficient and deficient malemice afteroral exposure to benzo(a) pyrene[J].Environmental and Molecular Mutagenesis,2010,51(2):123-129.
〔4〕 江泉观.雄性生殖毒理学 [M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版,1994:225.
〔5〕 Zor T,Selinger Z.Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity:theoretical and experimental studies[J].Anal Biochem,1996,236 (2):302-308.
〔6〕 Singh N P,Mccoy M T,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Exp CellRes,1998,175(1):184-191.
〔7〕 丁训诚.男性生殖毒理学 [M].北京:中国人口出版社,1997:204-205.
〔8〕 李湘鸣,居中华,孙蓉,等.镉对大鼠睾丸中某些酶活性及组织形态的影响 [J].卫生毒理学杂志,1999,13(1):31-33.
〔9〕 金明华,石龙,刘晓梅,等.苯并(a)芘对雄性小鼠睾丸细胞周期的影响 [J].中国公共卫生,2004,20(2):153-154.