研究证明川芎嗪不仅能扩张血管、改善微循环、抑制血小板聚集,并能有效抑制脑缺血导致的 Ca²⁺ 超载、拮抗氧化应激等,在治疗缺血性脑血管病方面有一定疗效 ^{〔1, 2〕}。但川芎嗪对增强缺血预处理 (ischemic preconditioning,IP ) 的脑保护作用方面报道较少。本研究利用沙鼠的前脑缺血预处理模型,用 4-PTT (4-pellet taking test)旱路迷宫及组织学方法,从海马神经元凋亡和星形胶质细胞变化角度,探讨川芎嗪预处理对脑缺血再灌注影响。

雄性健康蒙古沙鼠80只 (上海生物制品有限公司实验动物中心 ),9~ 12周龄,体重 (72±9.8) g。

川芎嗪注射液 (江苏润东医药有限公司 ) ; 神经胶质纤维酸性蛋白 (GFA P )兔多克隆抗体 (北京中山公司 ); 原位缺口末端标记法 (TUNEL ) 试剂盒 (上海 Roche 公司 ) ; 图像采集及图像分析系统 (美国 Bio-Rad 公司 )。4-PTT 旱路迷宫 (日本山形大学医学部 )。

80只沙鼠随机分成对照、脑缺血再灌注、缺血预处理和川芎嗪预处理组,每组 20只。参照 K irino^〔3〕方法制作沙鼠前脑缺血再灌注模型; 根据 K itagaw ^〔4〕方法制作脑缺血预处理模型。川芎嗪预处理组: 在脑缺血预处理前 30 m in尾静脉注射川芎嗪 (14.4 mg /kg ); 对照组只暴露血管,不夹闭颈总动脉。整个操作过程在显微镜下进行,术中监测肛温,手术中维持体温在 36. 8~ 37.2 ℃ 。

检测指标: (1)达到标准所需实验次数; (2) 每次完成实验所用时间; (3) 每次实验中从开始到吃掉第 1个食物所用时间; (4) 每次实验中非正确错误数。 (1) ~ (3)指动物通过训练后能正确完成实验,反映动物形成参照记忆,(4)指动物进入无食物盒次数、重复进入已吃掉食物食盒次数,反映动物本次实验中形成的工作记忆。动物在进入测试前 1 d进入迷宫训练 3次。 术后 3~ 7 d进行正式检测,上、下午各 1次,连续测试 5 d,结果取均值。

动物以戊巴比妥钠麻醉 (40 m g / kg ),用 40 g /L 多聚甲醛经左心室灌注固定后取脑,固定 24 h,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚 5 μm。苏木精 -伊红染色。每只鼠连续 3张冠状背侧海马切片,采用图像分析仪计数正常神经元,取均值。

标本多聚甲醛固定,经过脱水、透明 、浸蜡、包埋、切片,按试剂盒说明进行免疫组化染色 (SABC 法 ),步骤如下: 0. 3% 过氧化氢室温孵育、蒸馏水清洗、山羊血清、加兔抗鼠 GFA P 抗体 (1: 150)、4 c 过夜、磷酸盐缓冲液 (PBS)清洗、滴加二抗、链霉卵白素 + 辣根酶标记生物素 (SABC)、二氨基联苯胺 (DAB) 显色,苏木精复染。 多媒体彩色病理分析系统计数,取均值。

按 TUNEL 检测试剂盒进行操作,碱性磷酸酶底物显色。阳性率定量分析: 每个标本取 3张切片,每张切片在海马随机选取 4个视野,在 200倍光镜下应用目镜网格测试系统,计数阳性细胞。取均值。

应用 SPSS 12.0软件对数据进行方差分析,P < 0. 05 为差异有统计学意义。

与对照组比较,脑缺血再灌注组中沙鼠的参照记忆和工作记忆均有明显提高 (P < 0.05) ;与脑缺血再灌注组比较,缺血预处理组和川芎嗪预处理组中动物的参照记忆和工作记忆能力有较大改善,其中川芎嗪预处理组中改善更加明显 (P < 0. 05)。

表 1

表 1 各组沙鼠学习记忆指标结果比较( x±s , n= 10)

表 1 各组沙鼠学习记忆指标结果比较( x±s , n= 10)

对照组海马区神经元结构完整,排列整齐致密,未见变性坏死神经元; 缺血再灌注组海马区神经元大部分变性坏死,细胞间隙加大,细胞核浓缩、深染,溶解、消失; 缺血预处理和川芎嗪预处理组海马区存活的神经元较缺血再灌注组明显增多 (P < 0.05),大部分呈结构完整神经元。

表 2

表 2 各组沙鼠神经元密度、GFAP、TUNEL 细胞比较(x±s , n= 10)

表 2 各组沙鼠神经元密度、GFAP、TUNEL 细胞比较(x±s , n= 10)

对照组仅见少量 GFAP 染色阳性细胞,细胞数目很少,染色浅,突起细、短; 缺血再灌注组海马区 GFAP 表达较多、深染,细胞突起变长、增粗和分支增多,阳性细胞数目也增多 (P < 0. 05); 缺血预处理组和川芎嗪预处组 GFAP 阳性星形胶质细胞数目明显增多,染色更深,突起增粗,变长,分枝更多,甚至交织成网,川芎嗪预处组增多更加明显 (P < 0. 05)。

与对照组比较,脑缺血再灌注后 TUNEL 阳性细胞明显增多 (P < 0. 05); 与脑缺血再灌注组比较,缺血预处理组和川芎嗪预处组 TUN EL 阳性细胞减少,川芎嗪预处组减少更为明显 (P < 0.05)。

川芎嗪为中药川芎的有效成分之一,可抑制脑缺血后 Ca²⁺ 超载、拮抗氧化应激、阻断炎性反应与氧自由基之间的恶性循环及连锁反应、加速脑内保护性基因的转录等等 ^{〔6, 7〕},对脑损伤具有保护作用。本实验表明,缺血预处理和川芎嗪预处理组动物的参照记忆和工作记忆均明显改善,且改善程度在川芎嗪预处组中更明显,表明川芎嗪可改善脑缺血再灌注

沙鼠的学习记忆功能,提高脑缺血耐受能力。

星形胶质细胞是中枢神经系统的骨架细胞,可增强神经元对低糖和缺氧的耐受性; 并通过调节细胞外液 K⁺ 浓度、摄取谷氨酸、释放谷胱甘肽以及表达神经营养因子影响缺血性脑损伤的发展和转归 ^{〔8, 9〕}。本实验表明,缺血预处理和川芎嗪预处组中凋亡神经元数量减少,神经元密度增加; 同时星形胶质细胞标记物 G FAP 的表达增强,提示川芎嗪可提高星形胶质细胞的活性,从而增强脑缺血耐受能力。