铅是广泛存在于环境中具有神经毒性的重金属,长期接触可导致生物机体学习记忆、智力和情感状态等神经行为功能改变。海马是学习记忆的关键脑区,神经细胞的可塑性变化是学习记忆的重要结构基础,也是铅毒性作用靶部位。铅可改变海马超微结构^〔1〕、导致海马区神经细胞变性与凋亡^〔2〕,损害学习记忆。研究表明,蛋氨酸胆碱具有明显改善学习记忆能力作用^〔3〕。蛋氨酸是一种含硫氨基酸,在细胞内可以转化成谷胱甘肽,具有抗氧化损伤作用,胆碱是构建细胞结构完整性所必需物质,在宫内以及出生后补充胆碱可改变海马结构,提高学习记忆能力^〔4〕。本实验拟探讨蛋氨酸胆碱对铅所致海马神经细胞形态和结构损伤的改善作用。

三水合乙酸铅(上海试四赫维化工有限公司),分析纯; 胆碱、蛋氨酸( 加拿大BBI公司) ,硫堇 (英国Alfa A esar 公司) ; Z-8000AAS原子吸收仪、H-600 型透射电子显微镜(日本日立公司); CX31 显微及照相系统(日本OLYMPUS公司)。

初断乳( 21 d) SPF级SD大鼠(上海西普尔- 必凯实验动物有限公司) 40只,雄性,体重66.30~ 85.50 g。

将大鼠随机分为空白对照,染铅组,蛋氨酸胆碱组,铅+ 低、高剂量蛋氨酸胆碱组,每组8只。自由饮食饮水,铅染毒组饮用400 m g /L乙酸铅溶液,蛋氨酸胆碱组,铅+ 低、高剂量蛋氨酸胆碱组灌胃给予蛋氨酸胆碱混合液0.4、0.1、0.4 g /kg,每周灌胃6 d,连续灌胃4周和8周。

实验末用4% 异戊巴比妥钠( 80 mg /kg ) 腹腔注射麻醉,尾尖采血40 μL,采用原子吸收分光光度石墨炉法测定各样品中铅含量。

大鼠心脏灌注固定后,取出海马组织,2%戊二醛固定,脱水,浸透,包埋,超薄切片,电子染色,透射电镜观察海马超微结构。

石蜡切片脱蜡至水,硫堇染色,95%乙醇分化,脱水,透明,封片。细胞计数方法: 每组随机选取3个动物,每个动物做4张片子,每张片子在400倍镜下采用盲法数3个视野的细胞,最后以3个视野的细胞数总和进行统计分析。

采用SPSS 13.0 软件包进行多组均数方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义。

铅染毒后,染铅组大鼠血铅含量明显升高,同时给予蛋氨酸胆碱则可降低血铅含量,且与剂量有关。铅对海马神经元的损伤主要在 CA1区。染铅组CA1区神经元排列紊乱,可见神经元有缺失、坏死,细胞数量明显低于空白对照组(P < 0.01) ; 而铅+ 高剂量蛋氨酸胆碱组海马神经元数量及形态与空白组无差异 ( P > 0.05) 。

表 1

表 1 各组大鼠血铅浓度和海马CA1区神经元数( x±s , n= 8)

表 1 各组大鼠血铅浓度和海马CA1区神经元数( x±s, n= 8)

铅染毒4 周,染铅组、铅+ 低剂量蛋氨酸胆碱组可见少量线粒体空泡状(A) ; 染毒 8周,细胞器分布稀疏,出现空泡变性,细胞质溶解,粗面内质网扩张,脱颗粒,线粒体嵴发生断裂甚至消失,线粒体和核糖体数量减少,排列稀疏,结构异常(B); 铅+ 低剂量蛋氨酸胆碱组仍可见部分线粒体嵴消失、肿胀,部分粗面内质网扩张等,整体损伤程度较铅染毒组轻(C); 铅+ 高剂量蛋氨酸胆碱组出现高尔基复合体轻微肥大、其他细胞器结构接近正常(D)。

图 1

注: A: 铅染毒4周; B: 铅染毒8 周; C: 铅+ 低剂量蛋氨酸胆碱组 8周; D: 铅+ 高剂量蛋氨酸胆碱组8 周。 图 1 蛋氨酸胆碱对铅染毒大鼠海马神经元超微结构的改善作用( × 15 000)

海马区是大脑学习、记忆、行为关键部位,是铅暴露作用的靶部位之一。本研究结果显示,铅染毒4周时,血铅含量明显升高,但此时海马形态和结构未受到明显影响; 铅染毒时间增至8周时,血铅水平较4周时无明显改变,此时海马神经元形态和结构受到损伤,主要表现在CA1区,提示海马形态结构损伤出现相对较晚。给予不同浓度蛋氨酸胆碱干预后,血铅降低的同时,海马神经细胞形态和结构也逐渐得到恢复,呈现剂量- 效应关系。

铅可通过诱导活性氧自由基,抑制谷胱甘肽、超氧化歧化酶的活性,使神经元细胞氧化损伤,海马、纹状体等区域细胞密度降低,组织形态学改变等^〔5〕。蛋氨酸是一种含硫氨基酸,在细胞内可转化为谷胱甘肽,后者属于含有巯基的、小分子肽类物质,具有抗氧化作用和整合解毒作用。研究表明,蛋氨酸能提高海马一氧化氮合酶活性,增加海马一氧化氮含量^〔6〕及提高超氧化物歧化酶活力^〔7〕,抵御铅所致氧化损伤。 另外,蛋氨酸也是甲基供体,外源性的蛋氨酸可提高DNA 甲基化水平,抑制神经细胞的DNA 损伤,从而减低细胞的凋亡; 胆碱也可作为甲基供体,参与体内甲基代谢,胆碱转化为甜菜碱产生一碳单位的代谢可提供不稳态甲基,用于同型半胱氨酸形成蛋氨酸; 同时,胆碱是卵磷脂的组成成分,参与构成生物膜,在保证信息传递、调控细胞凋亡、促进脑发育和提高学习记忆中发挥重要作用,在宫内以及出生后补充胆碱可改变海马结构提高学习记忆能力^〔4〕。