二硫化碳 ( carbon disulf ide,C S₂ )是一种工业上广泛应用的有机溶剂 ^〔1〕 ,并且作业工人中女性众多。 流行病学调查显示,C S₂作业女工早早孕丢失率明显增高,且呈明显的剂量 - 反应关系 ^{〔2, 3〕}; 动物实验发现,在胚胎植入期暴露 C S₂ 的孕鼠其胚泡植入数明显减少 ^〔4〕,表明 C S₂ 具有明显的胚胎毒性, 可导致胚胎植入障碍 ,并且胚胎植入期是其毒作用的敏感时期。 在胚胎植入这一精细而复杂的过程中,粘附分子纤维粘连蛋白 ( f ibronec tin,FN ) 及其受体整合素 ( in teg r in) 在植入窗呈周期性表达,介导胚泡与子宫内膜之间的粘附 ^〔5〕。 本研究观察不同生殖阶段 C S₂暴露对小鼠孕 9d 胚胎和子宫组织中 FN 及其受体整合素 β₁ 表达水平影响,探讨 C S₂ 致胚胎植入障碍机制。

孕马血清 ( 天津实验动物中心 ); 人绒毛膜促性腺激素 ( hCG ) (上海第一生化药业有限公司 ); C S₂ (分析纯,济南启光科贸有限公司 ); R IPA 强效裂解液 (上海碧云天生物技术研究所 ); 苯甲基磺酰氟 ( PM SF ) 和二硫苏糖醇 ( DTT ) ( 美国 Sigm a公司 ) ; 兔抗鼠 FN 多克隆抗体、兔抗鼠整合素 β₁ 多克隆抗体和羊抗兔 IgG 多克隆抗体 (美国 Santa C ruz公司 )。

清洁级 8~ 12 周性成熟昆明种雌性小鼠 (体重 28~ 32 g ) 和雄性小鼠 (体重 36 ~ 40 g ),单笼饲养,动物合格证号为: SCXK (鲁 ) 20030004( 山东大学动物实验室 )。 小鼠自由饮食,自然采光,室温在 22 ℃ 、湿度在 50 % 左右。 雌性小鼠按体重随机分为 4组: 卵泡发育期染毒组、胚胎植入期染毒组 (包括植入早期与植入晚期染毒组 )和对照组。 若雌鼠连续 3 d合笼失败,则弃用。

雌性小鼠腹腔注射 10 U 孕马血清,48 h后腹腔注射 10 U hCG,按雌: 雄 = 1:1 合笼,次日检查阴栓。 阴栓阳性日为孕 1 d ,记为 D 1。

染毒剂量 631.4 m g /kg,溶剂用玉米油,注射容积为 0.1 mL /10g体重,对照组注射等量玉米油。 腹腔注射染毒。染毒时间: 卵泡发育期染毒时间为促排卵期,即在注射孕马血清后 14及 38 h各染毒 1次。 胚胎植入期染毒时间为孕 D4至 D7 ,其中植入早期染毒组于孕 D 4与 D5染毒,植入晚期染毒组于孕 D6与 D7染毒。 每天 1次,连续 2 d。

染毒期间记录体重。 小鼠孕 D 9称重后脱臼处死,摘取小鼠肝脏并称重。 剖腹取子宫,去除系膜和脂肪组织,滤纸吸干,从子宫角剪开子宫,计数每只子宫角的胚泡植入数。 胚胎和子宫组织 -80 ℃保存。 每组随机选取 3 只小鼠的胚胎与子宫组织进行检测,每个样本重复检测 3次。

按每 200 m g /mL 加入 R IPA裂解液 (含 2 mmo l/L孕马血清和 2 mmo l/L DTT )分别手动匀浆提取胚胎和子宫组织总蛋白,取上清液用 B radford 法测定蛋白含量。 上样总体积为 40 μL,其中包括 200 μg FN 或 50 μg整合素 β₁。 经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转印到硝酸纤维素膜上。 室温封闭 20 m in ,然后与兔抗鼠 FN多克隆抗体或整合素 β₁ 多克隆抗体 ( 1:200 稀释 ) 孵育,4 ℃过夜,次日漂洗后与羊抗兔 IgG多克隆抗体 ( 1:1 500 稀释 )室温孵育 2 h,漂洗后用二氨基职苯胺显色液显色至棕色条带清晰。 用 D uoScan T 1200扫描仪扫描蛋白条带进行灰度分析。

采用 SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析 (数据组间方差齐 )或非参数统计 T est( 数据组间方差不齐 )。 检验水准取双侧 α= 0.05。

与对照组比较,卵泡发育期染毒组胚胎组织中 FN 表达水平减少了 44.6% (P < 0.01),但整合素 β₁ 下降不明显; 胚胎植入期染毒组胚胎组织中 FN 和整合素 β₁ 表达水平分别减少了 54.8 % 和 10.4% ,差异均有统计学意义 ( P < 0.05)。 与对照组比较,卵泡发育期与胚胎植入期染毒组子宫组织中 FN 和整合素 β₁ 表达水平均明显减少,分别下降了 69.4 % 、 16.0% 和 52.5% 、 21.1% ,差异均有统计学意义 ( P < 0.01)。

表 1

表 1 CS2 染毒对胚胎和子宫组织中FN和整合素β1表达水平的影响(x ± s)

表 1 CS2 染毒对胚胎和子宫组织中FN和整合素β1表达水平的影响(x ± s)

染毒期间孕鼠肝脏重量、 肝脏系数组间比较差异无统计学意义,胚胎植入期染毒组与对照组比较,体重增重明显降低 (P < 0.05)。 与对照组比较, 胚胎植入期染毒组胚泡植入数减少了 36.8% ( P < 0.01),特别在植入晚期染毒约有 47.5 % 的胚泡丢失,但是在植入早期染毒胚泡植入数下降不明显 ( P > 0.05)。 虽然卵泡发育期染毒组胚泡植入数也有一定程度的减少,但与对照组比较差异无统计学意义 (P > 0.05)。

表 2

表 2 CS2 染毒对胚泡植入数和孕鼠的影响(x±s)

表 2 CS2 染毒对胚泡植入数和孕鼠的影响(x±s)

胚胎植入是哺乳动物生殖过程中关键环节,包括胚泡与子宫内膜的相互识别、粘附和侵入。 在孕早期,子宫内膜接受胚泡的特定时期被称为植入窗 ^〔6〕,对于小鼠而言发生在孕后 4. 5d至 6. 5d。 近期研究表明,以纤维粘连蛋白及其受体整合素为代表的粘附分子在植入窗呈周期性表达 ^〔5〕,为营造着床微环境和调节植入发挥重要作用 ^{〔7, 8〕}。 在孕鼠子宫腔内注射 FN 抗体血清可引起胚泡植入数明显下降 ^〔9〕,而子宫内膜整合素异常表达也可导致反复流产 ^〔10〕。 提示 FN 及其受体整合素与胚胎植入过程密切相关。

本次实验结果表明,植入期染毒组胚胎和子宫组织中 FN 及整合素 β₁ 的表达水平均明显降低,但卵泡发育期染毒组胚胎组织中整合素β₁ 表达水平并无明显变化。 同时,植入期染毒组胚泡植入数明显下降,特别在植入晚期可造成近半数胚胎丢失,但在卵泡发育期染毒组则只有轻微减少。 与卵泡发育期比较,胚胎植入期 (特别是植入晚期 ) 对 C S₂ 胚胎毒性更为敏感,并且胚胎植入障碍与 FN及整合素 β₁ 异常表达密切相关。 从结果中也可以看出,C S₂染毒虽然均可降低 FN和整合素 β₁ 表达水平,但其对整合素 β₁ 影响不如 FN 明显。 这是因为除 β₁ 外,尚有其他多种整合素亚单位 (如 α₅,α_{Ⅱ b},α_v, β₃等 ^〔11〕 )可作为 FN配体与其结合 ,所以 C S₂ 不仅影响 β₁ 正常表达,也可通过影响其他整合素亚单位从而导致胚胎植入障碍。