过度的凋亡是机体受到环境有害刺激因素作用产生损伤的主要机制之一。 诱导细胞凋亡因素较多,如应激因素、毒物、肿瘤环死因子、缺氧、高温和内毒素等。 近年,国内外众多学者从不同方面阐明了高温对细胞凋亡的诱导作用 ^{〔1, 2, 3, 4〕},而有关内毒素诱导细胞凋亡的机制报道也较多 ^{〔5, 6, 7, 8〕}。 本研究探讨高温 ( 40℃ ) 和内毒素同时存在对巨噬细胞系 RAW 264. 7 细胞凋亡的影响,为研究机体损伤的发生、发展及其预防治疗方案的选择提供依据。

小鼠来源的巨噬细胞系,用沙氏琼脂培养基 ( RPM I-1640培养基,含 10 % 灭活小牛血清、 100 U / mL青霉素和 100 Ug/mL链霉素,pH 7.1~ 7.2)传代培养。

细菌内毒素 ( LPS,美国 Sinm a公司 ),用 RPM I-1640(美国 G ibco公司 )配成 100 μg /mL的储存液置于 -70 ℃ 冰箱促存,临用前稀释成 20 μg/mL 的工作液; RPM I- 1640按说明书配成所需溶液; 小牛血清 (杭州四季青公司 ), 灭活后分装,于 -20 ℃ 保存; 胰酶 ( 美国 G ibco公司 )用 D-H a- nkps液配戌 0. 255溶液,4 ℃ 冰箱保存。

用完全培养基传代培养。 实验时用 0.25% 胰酶消化细胞后收集细胞,细胞浓度调制为 ( 1~ 2)×10⁵ /mL 分装入 4 个培养瓶中,95% O₂、 5% CO₂、 37℃ 条件下培养 12~ 18 h后用于实验。

实验分 4个组,依次为 37℃ 空白组 ( 37℃ BLANK 组 )、 37℃ 内毒素组 ( 37℃ LPS 组 )、 40℃ 空白组 ( 40℃ BLANK 组 )和 40℃ 内毒素组 ( 40℃ LPS 组 ) 。 每个处理组选用 2块 96孔板,向 96孔板中每孔加入细胞悬液 200 μL(共计 8块 96孔板,每板中设立 5 个复孔 )。 再向 37℃、 40℃ LPS组的培养板中各孔加入终浓度为 0.1 μg/mL 的 LPS。 将 37℃ BLANK 及 37℃ LPS组的培养板放入 37℃ 含 95% O2、 5% CO2 的细胞培养箱中,将 40℃ BLANK及 40℃ LPS组的培养板放入 40℃ 含 95% O₂、 5% CO₂ 的细胞培养箱中,于 3 h后分别从 37℃和 40℃ 细胞培养箱中取出 BLANK 组及 LPS组实验用 96 孔板各 1块,向各培养有细胞的复孔中分别加入 200 μL 0.5% 台盼蓝染液,并用 100 μL的微量移液器反复吹打,使细胞与染液充分混匀。 于倒置显微镜下进行细胞计数,活细胞圆形、透亮,死细胞呈蓝色,并用死细胞占计数细胞的百分比表示细胞死亡率。 用流式细胞仪记录细胞凋亡情况。 24 h后再将剩余的 96孔板取出,重复上述操作。

每组收集 5×10⁶ ~ 5×10⁷个细胞,裂解细胞并提取 DNA成分,2% 琼脂糖凝胶电泳 ( 电压 40 V,时间 2 h)后,紫外灯下观察并拍照。

采用 SPSS 13.0软件进行分析,组间差异比较采用 t检验。

37℃ BLANK 3 h组和 BLANK 24 h组的细胞凋亡不明显,凋亡率分别为 ( 3.6 ± 0.7)% 和 ( 4.6 ± 1.9) % ,同时也未检测到 37℃ LPS 3 h组有明显的细胞凋亡,凋亡率为 ( 2.8 ± 0.6)% ; 37℃ LPS 24 h 组的细胞凋亡率为 ( 13. 4 ± 5.5)% ,与 37℃ BLANK 24 h组比较,凋亡程度严重,差异有统计学意义 ( P < 0. 05); 此外,40℃ LPS组凋亡情况亦较 37℃ 组严重,其中 40℃ LPS 3 h组凋亡率为 ( 6.7 ± 0.6) % ,与 37℃ BLANK 3 h组、 40℃ BLANK 3 h组比较,差异有统计学意义 ( P < 0.01,P < 0.05); 40℃ BLANK 3 h 组的凋亡率较 37℃ BLANK 3 h组虽有所增加,但 2组间差异无统计学意义 ( P > 0.05) ; 随着时间的延长,37℃ LPS 24 h组、 40℃ LPS 24 h组的细胞凋亡情况明显加重,与同温度不同时间组比较差异均有统计学意义 ( P < 0.05,P < 0.01,P < 0.01); 40℃ LPS 24 h 组凋亡率升高更为明显 [凋亡率 ( 67. 4 ± 3.8)%] ,与其他组比较,差异有统计学意义 ( P < 0.05)。

特异长度的 DNA 片段为细胞凋亡的生化标志性指标。 RAW 264.7细胞按实验设计处理 3 h后和继续培养 24 h后提取细胞总 DNA 并进行 DNA 片段化检测,结果表明,37℃ BLANK 3 h组和 37℃ BLANK 24 h组未见断裂的 DNA 片段条带,而 37℃ LPS 3 h组和 37℃ LPS 24 h组隐约可见断裂的 DNA片段条带; 40℃ BLANK组 DNA片段化较 37℃ BLANK 组凋亡明显。 可见,高温内毒素复合因素加重了细胞的凋亡,并随着时间的延长表现愈加明显。 其中 40℃ LPS 24 h组已出现了典型的细胞凋亡 DNA 片段特征条带- DNA Ladder。 说明无论高温或者应用内毒素处理均对 RAW 264. 7细胞凋亡的发生具有重要作用,而两者联合应用将进一步加重 RAW 264. 7细胞损伤,出现大量细胞凋亡,并且损伤作用具有时间依赖性。

近年研究表明,不但高温对细胞有杀伤作用 ^{〔1, 2, 3, 4〕},内毒素亦是诱导细胞凋亡的一个重要因素 ^{〔5, 6, 7, 8〕}。 本研究结果表明,无论是单独应用高温处理还是单独应用内毒素处理均可诱发细胞凋亡,而且随着处理时间的延长,细胞凋亡呈进一步加剧趋势。其可能原因为细胞对外界环境刺激具有一定的抵抗能力,而凋亡相关受体的表达也需一定时间,故在细胞处理初期凋亡情况相对轻微; 随着时间推移,越来越多的凋亡相关受体被诱发表达,细胞凋亡情况也随之愈发严重。同时还发现,与单独因素处理组比较,高温复合内毒素处理后能引起细胞更大程度、更严重的凋亡反应,而且停止加入内毒素处理后一定时间内,这种细胞凋亡作用仍在进行。据此推测,高温和内毒素均能通过诱导凋亡相关受体表达而起作用,它们之间可能存在某种协同作用。后期虽然停止了内毒素处理,但由于编辑凋亡相关受体的基因已被激活,凋亡相关受体在一定时间内继续表达,所以细胞凋亡仍会持续下去。 提示无论高温或者应用内毒素处理对 RAW246.7细胞凋亡均具有重要作用,而且,两者作用持续时间的长短也是细胞凋亡的重要影响因素; 高温内毒素复合因素对细胞凋亡有协同作用 ^{〔9, 10〕},将进一步加重细胞损伤,使其大量凋亡,但其协同作用的具体机制尚待进一步研究。