风疹是由风疹病毒(rubella virus,RV)引起的急性呼吸道传染病,一般感染后症状轻微,并发症较少。但妊娠期妇女感染风疹后易引起流产、死产或婴儿出生后引起先天性风疹综合症(CRS),给家庭和社会造成沉重的经济负担和社会负担^〔1〕。风疹与麻疹在流行病学特征上比较相似,临床上不易鉴别。因此,风疹的发病也增加了麻疹监测和控制工作的难度。世界卫生组织(WHO)建议,随着全球各区消除麻疹目标的提出,要将风疹和CRS 的监测纳入到麻疹监测中^〔2〕。因此,风疹病毒的分子流行病学研究将是实现风疹控制和消除的基础工作。为了解现阶段辽宁省风疹病毒基因特征,本研究对2007-2008 年分离出的22株风疹病毒进行了分析,结果报告如下。

参照WHO《麻疹与风疹病毒感染的实验室诊断手册》^〔3〕要求,采集2007-2008年辽宁省风疹暴发和散发患者的咽拭子标本进行病毒分离,同时采集患者的血清标本进行风疹IgM 抗体检测。所有标本均置于-80℃保存。

风疹IgM 抗体检测试剂盒(深圳科润达生物试剂公司),RNA提取试剂盒(Rneasy minikit,德国QIA-GEN 公司),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 试剂盒(日本 TaKaRa公司),QIAGEN onestep RT-PCR kit(德国QIAGEN 公司) ,Quick Gel Extration Kit(德国QIAGEN 公司),2% 琼脂糖凝胶(美国Promega公司),Vero /Slam 细胞(国家麻疹实验室) ,PCR 产物克隆用载体pMD 19 -T、JM 109 感受态细胞(日本TaKaRa公司)。

(1) 抗体检测: 采用抗体捕捉酶联免疫吸附实验(ELISA) 试剂盒法检测患者血清中风疹IgM 抗体,具体方法按照说明书。(2) 病毒分离: 将处理好的标本接种到长成单层的Vero /Slam 细胞上,每细胞瓶接种0.3 mL,35℃吸附1. 5 h后加维持液进行培养。逐日观察细胞病变(CPE)和液体pH 值变化。CPE达到75%-90% 时将细胞瓶置于-80℃冻存以备传代或鉴定; 未发生CPE 的继续培养至第3代后经过RT -PCR鉴定为阴性后判为阴性。

使用RNA 提取试剂盒从病毒悬液中提取RV RNA。在逆转录酶(AMV) 的作用下合成互补脱氧核糖核酸 (cDNA),反应条件为42℃逆转录60 min,95℃变性5 min,4℃5 min。然后以病毒cDNA 为模板进行PCR 分析,PCR 反应条件: 95 ℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35个循环,72℃延伸10 min。PCR结束后,扩增的特异性片段约长185 bp,经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

使用QIAGEN onestep RT-PCR kit一步法试剂盒扩增风疹病毒E 1基因(8656-9762 nt) 1 107 个核苷酸片断。阳性PCR产物采用胶回收试剂盒回收后,与质粒pMD 19-T载体连接,然后转化大肠埃希菌JM 109感受态细胞,通过蓝白斑筛选与菌落PCR鉴定,阳性克隆送北京三博远志生物技术有限责任公司测序,测序结果在GenBank中用Blastn进行比较分析。

序列资料以标准的图形文件(.ab1)保存,序列整理使用Sequencher4.0.5软件 (GeneCode,Ann Arbor,Michigan,USA),将1 107 个核苷酸片段序列截成用于分子流行病学监测所需的核苷酸片段739 个核苷酸; 从基因数据库下载RV各基因型的参考株序列,进行序列相关分析。多序列比对、氨基酸和核苷酸同源性分析使用序列分析软件Bio Edit Sequence Alignment Editor software7.0.5.1(North Carolina St University,USA)。

采集出疹3 d 内临床确诊风疹病例血清标本55 份,RIgM 抗体阳性30份,出疹3 d内血清RIgM 抗体阳性率为54.5%。采集出疹3 d内临床确诊风疹病例的咽拭子标本68 份,在Vero/Slam 细胞上进行病毒增殖和分离,共分离到病毒22株,分离率为32.34%。其中沈阳18 株、辽阳3 株、锦州1 株。22 株病毒分离株均采用RT -PCR方法扩增,经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,扩增产物在约185 bp处有一明显特异性条带,证实为风疹病毒。

22 株RV经RT-PCR方法扩增常规靶序列,1 107 bp处有一明显特异性条带; 对RV E1 基因739 个核苷酸片段进行核苷酸序列测定和鉴定,结果显示,22 株毒株均为1 E基因型。

图 1

图 1 2007- 2008 年辽宁省风疹病毒株与WHO各基因型参考株 [E1 基因739个核苷酸(8 731 - 9 469 nt)] 基因亲缘性关系树

将22 株RVE 1 基因的739 个核苷酸片段与世界卫生组织(WHO) RV 13个基因型的32 株参考株相对应的核苷酸片段一起构建基因亲缘关系树,结果显示,22株分离株在亲缘关系树上与WHO 提供的RV 1 E 基因型参考株(T 14-CH -02株和M 1-MAL-01 株)最为接近,在亲缘关系树形成一个分支,其同源性boo tstrp 值为 91%,并且与分离于中国的参考株T 14-CH􀀁02株在1E 基因型亲缘关系树上独立成簇,同源性bootstrp值为99%; 与其他国家1 E基因型参考株M 1-MAL-01株的同源性bootstrp值为91%。比对结果表明,辽宁省2007 -2008 年分离到的22 株RV均为1 E基因型,并且与中国的1 E基因型参考株高度同源,与其他国家的1 E基因型有一定的差别。

辽宁省2007 -2008 年分离的22 株风疹病毒之间核苷酸同源性为97.6% ~ 100%,氨基酸同源性为99.1% ~ 100%。22 株风疹病毒与WHO提供的RV 1 E基因型参考株(T 14 -CH -02 株和M 1-MAL-01株)的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0% ~ 99.1% 和 99.1% ~ 100%。与中国疫苗株BRDJI株比较,22 株RV 的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.5% ~ 90.2% 和99.1% ~ 99.5%。

RV 属于披膜病毒科(Togaviridae) RV 属的唯一成员,是引起风疹的病原体。WHO推荐将RV E 1基因的739 个核苷酸(8 731-9 469 nt)作为基因划分和常规分子流行病学研究的标准靶核苷酸序列,共划分为13 个基因型。研究表明,随着时间的推移各种基因型之间可能发生更替。1999 -2002 年中国风疹病毒的分子流行病学研究^〔4〕表明,中国风疹病毒有 4个基因型流行(1E、1F、2A 和2B),其中2A基因型为风疹病毒疫苗相关株,2B 基因型只在2000年安徽安庆一起风疹暴发中分离到。因此,这个时期的风疹病毒主要以1 E和1 F共流行为主。朱贞等^〔5〕研究表明,2003-2007 年中国10个省(未包括辽宁省) 57 株风疹病毒分离株全部属于1 E 和2 B 基因型。其中2 B基因型是2006 年四川省从越南留学生风疹暴发患者中分离到的^〔6〕。提示中国2003-2007 年风疹流行主要以1 E基因型为主,该基因型代替其它基因型逐渐成为中国的优势基因型。辽宁省从2007 年开始进行风疹病毒的分离,本研究结果表明,1 E基因型为2007-2008年辽宁省流行的风疹病毒优势基因型,与朱贞等^〔5〕人报道的结果相吻合。由于辽宁省此次风疹病毒分离仅限于沈阳、辽阳和锦州 3个市,且时间跨度仅为2 年,因此,1 E基因型是否为辽宁省现阶段仅有的基因型尚不能得出结论,仍需扩大地理监测范围进行深入的、持续的研究。