通常抗坏血酸总量被认为是维生素 C(Vitamin C,VC )和 其氧化形式二十二碳六烯酸 (docosahex aeno ic_ac id,DHA )的总和^{〔1, 2〕}。异抗坏血酸 ( cvythorbic acid,EA )及其氧化态也具有抗氧化活性 ^〔3〕。测定维生素 C通常采用滴定法、电位法和荧光分光光度法^〔4〕,这些方法共同的缺点是只能检测总抗坏血酸的含量,而未区分开 VC和 EA。液相色谱法通常要求柱前衍生后再分离,费时费力,在衍生化阶段抗坏血酸也会被氧化损失;或者在流动相中加入价格较贵的有机胺类离子对试剂,且对检测灵敏度有不利影响^〔5〕。本研究在参考文献^{〔1, 2, 3, 4, 5〕}基础上,建立同时检测总 VC和总 EA的液相色谱方法,现报告如下。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪 (美国安捷伦公司 ) ; BS224S电子分析天平 (美国赛多利斯科学仪器有限公司 ); Milli-Q Gradient超纯水机 (郑州南北仪器设备有限公司 ); Lunascx 100 A阳离子交换柱 ( 250 x 4. 6 mm,5 μm,美国菲罗门公司 ); ULTRA-TURRAX匀浆机 (上海楚柏实验室设备有限公司 )。乙腈 (色谱纯,美国 Tedia公司 );磷酸、偏磷酸、乙酸铵 (分析纯,北京益利精细化学品有限公司 );抗坏血酸 (中国国药集团化学试剂有限公司,含量为 99.7% );异抗坏血酸 (武汉鑫华远医药化工制造有限公司,含量为 99. 7% );二硫苏糖醇 ( dithio threitol,DTT,分析纯,德国 Merk公司 );过氧化氢 (天津市科密欧化学试剂开发中心,浓度为 30% );超纯水 (自制 )。

1.2 实验方法

(1)色谱条件: Lunascx 100A阳离子交换柱,柱温 30℃ ;检测波长 243 nm,流动相为乙腈 - 0.1 %磷酸水溶液 (95:5),流速为 1.2 mL /min,进样体积 5 μL。 (2)检测波长的选择:取 VC和 EA标准溶液适量,分别进样,用二极管阵列紫外检测器记录色谱图和光谱图,发现在此色谱条件下 VC和 EA的最大吸收均在 243 nm。 ( 3)流动相的选择:在酸性流动相条件下,VC和 EA在 SCX型阳离子交换柱上可以被保留和分离,通过优化实验条件,最终建立用阳离子交换色谱柱分离检测 VC和 EA的液相色谱方法。实验中,流动相中乙腈比例从 98%~60%改变,分别测定 VC和 EA的保留时间,计算容量因子k',二元混合流动相中强溶剂 0.1%磷酸水溶液在流动相中所占比例的对数,与 VC和 EA容量因子的对数成线性关系,对一般液相色谱来讲,ln k'= a + b· ln C_B + c· C_B…公式^〔6〕。研究 VC和异 VC在阳离子交换柱上的保留机理;比较不同流动相下 VC和异 VC的理论塔板数和分离度,找到 VC和异 VC检测的最佳流动相比例。

1.3 操作步骤

(1)标准曲线绘制:分别称取抗坏血酸和异抗坏血酸标准品 100 mg,加 0.1%偏磷酸水溶液溶解并定容至 100 mL,得浓度为 1mg /ml的抗坏血酸和异抗坏血酸标准溶液;分别吸取 VC、EA标准溶液 0.5,1,2,4,10 mL,加流动相稀释并定容至 100 mL,得浓度为 0.005,0.01,0. 02,0.04,0.10 m g /mL的 VC和 EA混合标准溶液,在液相色谱仪中记录峰面积,绘制标准曲线。 (2)样品处理:准确称取强化饮料 (超市购买 ) 5.00 g置于 50 mL容量瓶中,加提取液适量,振荡混匀后加提取液定容至刻度,避光室温放置 2 h后,0.45 μm微孔滤膜过滤,待测。分别准确称取果汁、婴幼儿奶粉、保健食品 (超市购买 ) 5.00 g置于 100 mL烧杯中,加提取液约 30 mL,在冰水浴中 10 000 r/m in匀浆 1 m in,过滤,收集滤液加提取液定容至 50ml避光室温放置 2h后,0.45 μm微孔滤膜过滤,待测。提取液为 1.00 g DTT置于 500 mL容量瓶中,加 0. 1%偏磷酸水溶液 200 mL振荡溶解,加乙腈定容至刻度。 (3)氧化态 VC和 EA的还原:取浓度为 0.4 mg /mL的 VC和 EA混合标准溶液 20 mL,加入 30 %过氧化氢 30 μL ,50℃水浴下 1 h,使 VC和 EA充分氧化,取 1mL溶液进样,在液相色谱仪中记录峰面积;在此溶液中加入 40 mg还原剂 DTT,振荡混匀后,每 20 min取样测定,在液相色谱仪中分别记录峰面积。 (4) DTT使用量的确定:配制含 DTT浓度为 0.00,0.10 ,0.20,0.50,2.00,5.00 mg /mL的样品提取溶液。取制备好的氧化态 VC和 EA标准试样 6份,每份 1 mL,分别加入以上不同浓度的试样提取液 9 mL,室温放置 2h,在液相色谱仪中记录峰面积。 (5)精密度和回收率计算:取浓度为 0. 4 mg /mL的 VC和 EA混合标准溶液 20mL,加入 30%过氧化氢 1 mL ,放置 1 h,使 VC和 EA充分氧化。取此试样 6份,每份 5 mL,置于 50 mL容量瓶中,分别加入 0.20 mg /mL的 DTT提取液并定容至刻度,室温放置 2h后,按照 1.3中的色谱条件进样,并在液相色谱中记录色谱峰面积。 (6)检出限:取浓度为 0.005 mg /mL的混合标准溶液,按照 1.2中的色谱条件进样 5 μL,计算信噪比,按 3倍信噪比计算检出限。

2 结 果 2.1 流动相的选择

VC和 EA最大吸收波长均在 243 nm,乙腈比例为 98%~60%时,VC保留时间为 10.84~3.53m in,EA保留时间为 7.29 ~3.47min,理论塔板数分别为 12872~5376和 12619~4811;分离度为 5.75~ 0。最终选定乙腈比例为 95% ,此时二者的分离度较好,理论塔板数较高,保留时间也比较长。容量因子线性方程分别为: VC: y = -0. 3669x -0.0422,r₂ = 0.9925; EA: y = -0.5137x - 0.1807,r₂ = 0. 9995,式中: y = lnk'，为容量因子的对数; x为 0.1 %磷酸水溶液在流动相中所占比例的对数,ln(v/v)。

2.2 氧化态VC和EA的还原

未添加过氧化氢的标准溶液峰面积 EA为 252. 2,VC为 223. 6,添加 30 μL过氧化氢后峰面积 EA为 45.2,VC为 32. 4;峰面积随着时间延长而增大,在 120 min达到最大。 DTT添加 20~ 140 min后,EA峰面积为 137.4~ 248.2,VC峰面积为 106.6 ~ 242.3,均在添加 12 0min后达到最大值,故 DTT还原时间为 2 h。

2.3 DTT使用量的确定

DTT添加量从 0~5.00 m g /mL变化时,EA的峰面积从17.5~ 253.4递增,VC的峰面积从12.9 ~ 248.9递增,当提取液中 DTT浓度 > 2.0 mg /mL即可使还原反应进行完全,最终确定提取液中添加 DTT的含量为 2.0 mg /mL,还原时间为 2 h。

2.4 标准曲线和检出限

EA的线性回归方程为: y = 210174.731x - 22.14723,r² = 0. 99984; VC的线性回归方程为: y = 210174.731x - 22. 14723,r² = 0.99952。 y:峰面积,x:试液浓度。计算信噪比为 20,检出限为 0. 1 μg /mL;按样品取样量 5 g,定容 50 mL计算,方法检出限为 1 mg /kg。

2.5 精密度和回收率

EA精密度为 5.31% ,回收率范围为 86. 8%~99.6% ; VC精密度为 4.48% ,回收率范围为 89.4~ 99.7% 。强化饮料、果汁、婴幼儿奶粉、保健食品中 VC含量分别为 15. 8、27. 6、32. 1、21.7 mg /100 g,相对标准偏差 ( RSD )值依次为 5.2% 、7.1% 、6.8% 、7.2% ; EA只在强化饮料中检出,为 13.8 mg /100 g,RSD = 6.2% 。

3 讨 论

在本研究的色谱条件下,VC和 EA由于液 -固吸附被保留和分离,符合正相色谱分离规律,二者保留时间较长,分别为 7.30 m in和 5.93 min,其中 V C保留时间要长于文献中的 2 min左右^〔7〕和 4. 67 min^〔8〕。

流动相 pH值 > 2.5时,VC或 EA峰型变差,不能达到分离效果;增加流动相中缓冲盐浓度,V C或 EA保留时间变化很小,与一般离子交换色谱不同。降低流动相中强洗脱剂 0.1 %磷酸水溶液的比例,将延长溶质保留时间,提高分离效果。由于 VC和 EA在有机溶剂中溶解度低,当流动相中乙腈比例 > 95 % ,VC和 EA的峰型变差,理论塔板数降低较多。此方法样品前处理简便,具有较高的回收率,重现性好,可应用于强化食品中抗坏血酸总量和异抗坏血酸总量的测定,为检测食品中抗坏血酸和异抗坏血酸含量提供了技术依据。对于其他成分复杂的食品中抗坏血酸总量和异抗坏血酸总量的测定方法,还有待进一步研究。