新生小牛血清是生物制品生产中一种重要的原材料,是细胞培养中不可缺少的营养成分,小牛血清的质量直接影响生物制品质量。国家在新版《中国药典》中对小牛血清质量提出了严格的检测标准,其中病毒外源因子检测是重要的指标之一。尽管小牛血清经过多级过滤系统的过滤,达到了去除细菌和支原体目的,但病毒等外源因子因分子量小仍无法去除。本实验采用辐照方法对辐照前、后小牛血清中牛腹泻病毒检测和牛血清细胞倍增时间测定效果进行比较,现将结果报告如下。

(1)待检小牛血清:初制小牛血清(沈阳辉山金辉畜牧生物有限公司),经辽宁省疾病预防控制中心自检牛腹泻病毒呈阳性的8批小牛血清和这8批经过辐照后的小牛血清。(2)牛肾原代细胞制备:用新鲜健康的新生小牛肾制备原代细胞。(3)阳性对照:牛腹泻病毒(BA)株(中国兽药监察所)。(4)静态辐照方式:血清样品由辽宁钴源辐照中心进行照射,采用单栅板源照射,⁶⁰ Cov源活度为7.4 PBq (20万ci)。将小牛血清样品摆放在辐照源的2侧,吸收剂量为10 KGy。(5)其他材料:阴性对照牛血清、胰酶及达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(美国GIBCO公司)。

制备牛肾原代细胞,将第4代和第5代细胞接种到96孔培养板上,37 ℃培养2 h后,将牛腹泻病毒稀释后,分别接种到经上述培养的细胞板中,每孔0.1 mL,同时设立阴性对照,72 h镜下观察细胞病变结果。

用直接病变法将经检测敏感的第5代细胞接种培养板中,每孔0.1 mL,37 ℃培养2 h后分别加入等量的辐照前和辐照后小牛血清,同时设立阳性对照和阴性对照。72 h镜下观察细胞病变结果。以上实验用5%结晶紫染色液染色后判定结果,按常规方法染色。

将SP_2/0骨髓瘤细胞接种于含有10%待检小牛血清的培养基中适应培养1周,隔天传代1次,每mL以10⁴个细胞接种到96孔培养板中,每天计数1孔,到细胞全部死亡。用细胞动态测定过程中细胞数峰值前1 d所计得的数(x),达到该数的倍增次数(y)及所需时间(t)来计算细胞培增时间。即:增倍时间(DT)=t/y,其中y=log2^x。

牛肾原代第4代和第5代细胞在接种10^-4稀释的牛腹泻病毒时不同代次均出现明显的细胞病变,结果均无差别。

结果显示,辐照前的8批牛血清检测结果均出现了明显的细胞病变,而经剂量为10 KGyv射线辐照后的相同8批牛血清检测结果均未出现细胞病变。

表 1

表 1 辐照前后牛血清细胞倍增时间比较

表 1 辐照前后牛血清细胞倍增时间比较

对8批未照射和经剂量为10 kGyv射线照射的小牛血清进行细胞倍增时间对比测定。由表l可见,2组倍增时间均数分别为16.56及16.61 h,2组均数间差异无统计学意义(P > 0.05)。

由于母牛生存条件及环境不同,使母牛有感染不同病毒的可能,因而使新生小牛血清中也存在不同的病毒,去除牛血清中病毒外源因子污染困难较多,本实验采用辐照方法既经济又简便。通过对辐照前、后牛血清牛腹泻病毒的检测比较,得出辐照可以杀灭牛腹泻病毒,细胞倍增时间的检测证明这8批辐照前、后的牛血清对细胞培养时间没有改变,即牛血清对促进细胞生长无不良影响,因此辐照是去除小牛血清中牛腹泻病毒的有效方法,杀灭牛腹泻病毒对提高小牛血清的质量有着重要的意义。辐照对其他病毒的杀灭效果有待进一步研究^〔2〕。