环境雌激素(environmental estrogens,EES)是最重要的一类环境内分泌干扰物,大量研究结果表明,环境雌激素(如双酚A、邻苯二甲酸酯等)对动物雌激素、睾酮等的生理作用有明显协同或拮抗干扰效应,是生殖障碍、生殖系统畸形、发育异常、代谢紊乱以及某些恶性肿瘤发病率增加的原因之一^{〔1, 2, 3, 4〕}。气相色谱-质谱联用(GC-MS)的化学分析方法对环境雌激素的检测需要复杂的样本前处理过程,并且很难达到所有痕量成分的完全解析。因此发展高通量的生物学方法,以应对日益增多的雌激素类污染检测十分必要。本研究就近年发展起来的环境雌激素各种生物学检测方法的特点和局限性进行综述。

重组基因酵母检测法将带有雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)的报告质粒和带有人类雌激素受体(human estrogen receptor,hER)的表达质粒同时转染酵母细胞,报告质粒上还带有能编码β-半乳糖苷酶的基因Lac-Z。在雌激素存在时,hER被激活发生变构,与ERE结合,再通过转录因子的协同作用,引起报告基因Lac-Z的表达,产生β-半乳糖苷酶。通过检测β-半乳糖苷酶的活性定量检测出样品的雌激素活性。

重组基因酵母检测法操作简单,且具有高度的敏感性。1997年,G aido等^〔5〕首次建立了重组酵母测评体系,对雌二醇(estradio,lE₂)的检测灵敏度可达到10-12 mol/L。Coldham等^〔6〕应用重组基因酵母法对E₂检测灵敏度进行评估,表明此方法比人体乳腺癌细胞系MCF-7增殖实验和子宫增重实验高2~5个数量级。由于酵母不含雌激素受体(estrogen receptor,ER),克服了内源性ER的影响。重组酵母法将生物体内复杂的新陈代谢和信号通路简化为受体配体反应过程,使体外的检测实验更易实现,可操作性强。用其他激素类受体(如雄激素受体、孕激素受体)替代该体系中的雌激素受体,就可以构建检测环境雄激素和环境孕激素的实验体系,因此该方法的推广性好。

但是,在重组基因酵母检测体系中表现出雌激素活性的物质,在不同的生物体或细胞内不一定会产生类似的生物学效应,即可能出现假阳性结果,如检测雌激素受体拮抗剂ICI64-384时,其仍能表现出一定的雌激素活性^〔5〕。同样,在乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖实验中,表现出类雌激素活性的邻苯二甲酸丁苄酯,在重组酵母法中未检测到其活性^〔5〕。而且在重组酵母体系中,尚不清楚酵母对EES的代谢情况,也不能反映受试物在哺乳动物体内可能存在的代谢后使EES活化或失活的情况^〔7〕,因此实验结果还需要动物实验进一步验证,这也是体外实验最大的局限。

Miege等^〔8〕在检测环境样品的雌激素污染时,对重组基因酵母法和分析化学法所测得的E₂当量(E₂ equivalent,EEQ)进行了分析比较。与重组基因酵母法比较,对城市暴雨径流水样,分析化学法所测得的EEQ较大。而检测来自污水处理厂下游的水样时,2种方法测得的EEQ接近。经分析,分析化学法测得的EEQ (Chem-E₂-EQ)与生物法所测得的EEQ (Bio-E₂-EQ)的大小与样品的物质组成有关。环境水样中雌激素类似物的相互抑制作用会导致Chem-E₂-EQ > Bio-E₂-EQ;而如果所测得的Chem-E₂-EQ < Bio-E₂-EQ,其原因可能是环境样品中的某些雌激素类似物含量太低,以致分析化学法不能检出,但其雌激素效应仍能在生物法中得到体现。

酵母双杂交法在普通重组基因酵母法配体受体结合的基础上,又引入了受体和辅激活蛋白之间的配体依赖作用。将ER与酵母转录因子(ga lac to sidase 4,GAL₄)的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)融合,辅激活蛋白与转录激活域(activation domain,AD)融合分别构建2个质粒。当雌激素存在时,ER与雌激素由于受体配体作用而结合到一起,然后ER与辅激活蛋白发生相互作用,导致BD与AD在空间上接近,从而激活下游启动子调节的Lac-Z报告基因表达,产生β-半乳糖苷酶,以此来检测环境雌激素。

与重组基因酵母法比较,酵母双杂交法除把人类雌激素受体导入酵母细胞外,还把辅激活蛋白同时转入酵母细胞中,从而使其更加接近于生物体的内分泌系统,减少假阳性结果的出现。有了hER和辅激活蛋白的共同检测作用,酵母双杂交法具有更高的稳定性和可重复性,并且能够将雌激素活性细化到其与受体结合的能力和富集辅激活蛋白的能力。李剑等^〔9〕应用酵母双杂交技术构建了ER+GPDP1和ER+SRC1 2种ER双杂交酵母,并观察了不同激素(E₂、二氢睾酮、孕酮等)的结合能力,结果显示E₂对2种酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的半数有效浓度(the half-effective concentration,EC₅₀)分别达到73 pmol/L和150 pmol/L,略高于Ga ido等^〔5〕应用重组酵母体系对E₂的检测效能(EC₅₀=225 pmol/L)。但该检测方法的实际下游应用如环境样品的测评等尚未见报道。

日本学者Kim等^〔10〕将结合有生物素标记的ERE DNA探针的抗生物素蛋白结合于附有琼脂糖凝胶的阵列玻片上,建立了DNA阵列玻片筛选雌激素类物质的方法。首先黄色荧光蛋白-人雌激素受体α融合蛋白(yellow fluorescent prote in-fused hERα,YEP-hERα)与雌激素结合,再与凝胶层的ERE结合,洗涤后用酶标仪检测通过ERE结合在凝胶层上YEP-hERα-雌二醇复合物的荧光强度,从而对样品中雌激素含量进行定量。

Kim等^〔10〕用该方法测得雌激素活性大小:己烯雌酚(diethylstilbestro,l DES)>雌二醇(E₂)≒ 1 7 a-乙炔雌二醇(ethinylestradio,lEE₂)> 4-羟基三苯氧胺(4-hydro xytamoxifen,4-OHT)≥克罗米酚(clomiphene,Clo),其中DES、E₂、EE₂检测限分别为0.3×10^-13、1×10^-13、1.3×10^-13mol/L,E₂的线性范围为10^-13~10^-11 mol/L。该法不依赖其他生物体的作用(如酵母),影响因素更少,而且同样具有通量高、稳定性好等优点。其不足在于非特异性背景结合量大,干扰实验结果^〔10〕。

利用雌激素与ERα间受体配体结合原理和探针的实时荧光定量PCR技术,本实验室建立了一套体外评估雌激素类物质生物学效应的ERC-PCR方法^〔11〕。该方法模拟雌激素与ERα体内结合的生物学过程,以含ERE并与ERα有高亲和力的DNA序列作为结合探针,进行ERα体外受体-配体特异结合,形成配体-ER-DNA探针复合体(ERC),荧光定量检测DNA含量,从而评估环境雌激素的累加生物学效应,即复杂环境样品中各种雌激素类物质的累加毒性当量。

实验结果显示了良好的结合剂量-效应曲线,其中E₁、E₂、DES和DMP 4种激素类物质EC₅₀分别为890、19.9、790、6.31 pmol/L,最低检测限E₁和DMP可达1×10^-13 mol/L,E₂、DES可达1×10^-12 mol/L,E₂的线性范围为10^-12~10^-10 mol/L^〔11〕。虽然该检测体系有较高的检测效能(E₂的EC₅₀达到19.9 pmol/L,低于Gaido等^〔5〕的重组酵母测评体系中E₂的EC₅₀=225 pmol/L),但其下游应用仍需要继续探索。

在上述几种基于受体配体结合的环境雌激素筛检方法中,应注意到实验体系中ERE、ER蛋白、细胞系的种属特异性对实验结果的影响。在Gaido等^〔5〕的重组基因酵母法和Kim等^〔10〕的DNA阵列玻片实验中,ERE元件均来源于非洲爪蟾的卵黄蛋白原基因,且为2个拷贝。而本研究在ERC-PCR检测法中,探索了3种不同的DNA结合探针,分别为人源性的细胞色素c氧化酶Ⅶa亚单位相关蛋白基因COX7RP-ERE和非洲爪蟾的卵黄蛋白原A₂基因VitA₂-ERE,VitA₂×2ERE。与VitA₂-ERE比较,人源性COX7RP-ERE在ERα体外受体-配体结合过程中具有更好的亲和力。而同为来源于非洲爪蟾,带有2个ERE的VitA₂-2ERE的结合效能不如只带1个ERE的VitA₂-ERE ^〔11〕。可见ERE的种属源性及其拷贝数也是影响实验结果的一个因素。在Cosnefroy等^〔12〕的文献中,比较了虹鳟鱼肝细胞系PRTH (含内源性受体)、花鳉鱼肝细胞系PELN-rtER (含虹鳟鱼雌激素受体)、人乳腺癌细胞系MELN (含内源性受体)、人Hela细胞系HELN-rtER (含虹鳟鱼受体)4种不同来源细胞系检测E₂的灵敏度大小,结果为:PRTH < PELN-rtER< HELN-rtER< MELN。MELN的灵敏度最高可能是由于hER比rtER (rainbow trout estrogen receptor)对E₂有更强的亲和力和MELN中细胞系与ER的同源性。PELN-rtER法与PRTH (r²=0.91)和HELN-rtER (r²=0.90)相关性较好,而与MELN法的相关性仅为0.80,可见基于相同种属(如鱼类)而建立起来的方法间相关性更好。

免疫分析法是基于抗原和抗体特异性结合的分析方法。免疫分析法中以酶联免疫吸附法(ELISA)最为常用,其基本原理为根据待测的雌激素抗原制备高亲和力的特异性抗体,以抗体(或抗原)作为载体,利用介入酶反应测定吸附在载体上与抗体(或抗原)结合的抗原(或抗体)量。

Zhao等^〔13〕建立了环境水样和生物样品中双酚A(bisphenol A,BPA)的ELISA检测方法,其检测限分别为0.1 ng/mL (水样)和2 ng/mL (血样)。Ga rrett等^〔14〕利用特异性抗17β-E₂抗体检测样品中E₂的含量,结果显示半数抑制浓度IC50为1.8 ng/mL,检出限为0.2 ng/mL。试验中特异性抗E₂抗体与其他雌激素类物质的交叉反应同时被检测,雌三醇和雌酮显示一定的交叉反应(分别为116%和3.3%)。

ELISA法的高通量性、低试样量、低成本等优点使其具有良好的应用前景。但是该方法不能模拟环境雌激素类物质的生物学效应,只能针对单一成分制备相应抗体进行单一成份检测。而且免疫试剂制备耗时,且对某些雌激素缺乏特异性,灵敏度不及DNA阵列玻片筛选实验和重组基因酵母检测法。

综上,体外生物学筛检实验有较高的检测效能和较宽的线性范围,操作简单、成本低、易于推广,更主要是对环境雌激素类物质的综合生物学毒性有较好的反应度,并避免了体内实验的伦理学问题,是国内外学者探索的主要方向。

体内实验的关键在于选择合适的实验动物和易于检测的生理指标来进行实验。如鱼类卵黄蛋白原诱导实验,就是根据正常雄性体内不会含有卵黄蛋白原,在大剂量的人工雌激素作用下以及在低剂量的类雌激素长期作用下,都能诱导体内卵黄蛋白原的生成,从而检测经环境雌激素作用后的雄鱼体内的卵黄蛋白原的含量来评价环境样品的毒性。

查金苗等^〔15〕提出一套将日本青锵胚胎和幼鱼暴露于排放污水中,通过对暴露后的胚胎损坏死亡情况、孵化率、孵化时间、幼鱼畸形、平游失败率、生长(体重、体长)、性别比率、死亡率等指标进行观察和统计,从而评价排放污水的毒性和内分泌干扰效应的方法。

1998年,美国环保局内分泌干扰物筛检测试咨询委员会(Endocrine Disruptor Screening and TestingAdvisory Committee,EDSTAC)推出《环境内分泌干扰物筛检程序》^〔16〕,提出分层式筛选环境内分泌干扰物,其中第1级筛选就包括5项活体内试验,即鼠体子宫增生试验、青春期雌鼠甲状腺试验、鼠体H ershbe r分析试验、青蛙成长期蜕变测试、鱼性腺生殖分析;第2级检测阶段包括5项活体动物暴露实验,即哺乳类二代间生殖毒性测试(鼠)、鸟类生育繁衍影响测试(鹌鹑与野鸭)、鱼类生命周期测试(鰷鱼)、糠虾生活史、两栖类成长及生育繁衍能力测试(非洲蟾蜍),用以确证化学物质的内分泌干扰效应。

体内实验法的结果可靠,但是需进行大量的毒理学实验,以牺牲大量的实验动物为代价,并需要花费大量的人力物力,而且持续周期较长,不利于进行大规模实验。同时,不同种类的实验动物,不同生长阶段的同一种实验动物对同一环境雌激素均可能表现出不同的实验结果。因此,经体内实验法得出的结论也有一定的局限性。

总体上现有的检测方法有其优点,也有其特殊的局限性。大多数检测方法的敏感性较低而特异性偏高,耗时耗力,不适用于大范围的筛选。目前对于多种雌激素联合作用的内分泌干扰效应以及对人类健康综合效应方面的研究较少,还不能较好反映环境化合物对人体潜在危害。通过这些检测方法测定的结果尚有一定的局限性,不能简单由此推断其在人体内的作用。现有的检测方法操作较复杂,实验结果影响因素较多,与操作人员、操作环境有较大关系。在今后的研究中,拓宽筛选实验对环境雌激素的检测范围,降低其特异性,提高实验稳定性和可重复性将是研究重点和方向。