近年来,本课题组先后构建3 种人体带绦虫成虫全长 cDNA 质粒文库,为研究功能基因的结构、功能以及3种绦虫进化规律提供丰富的基因资源^{〔1, 2〕}。本研究从猪带绦虫成虫文库中筛选出一个延伸因子-1( e lo ng atiom facto r 1,EF􀀁1 )的同源基因,构建原核表达载体,为进一步研究其生物学功能奠定基础。

猪带绦虫虫体标本采自四川甘孜雅江地区医院患者。猪带绦虫成虫全长cDNA 质粒文库构建,大规模构建和标签( EST) 和UniGene分析与上海联合基因有限公司合作完成,UniGene通过Wub lastx方法进行识别^〔3〕。

TaKaRa Ex Taq TM 酶( 含 dNTP)、EcoR I、Xho I、DNA标准( DL15000、DL2000) (大连宝生物工程公司) ,异丙硫代-β-D 半乳糖( IPTG ) (美国pro-m eg a公司); 质粒提取试剂盒(广州东盛科技公司); DNA 凝胶回收试剂盒( 广州铂尔生物科技公司); 十二烷基磺酸钠 ( SDS)等试剂(上海申友生物技术公司)。

基因扩增引物由Introv i-gen上海生物技术有限公司合成,重组质粒DNA的测序由英俊科技股份有限公司完成。

通过NCB I网站的BLASTX 程序^〔4〕,将目的基因序列与GeneBank中的序列进行比对,判断该基因是否为全长基因,目的基因序列测序是否正确。

利用蛋白分析专家系统Ex pasy所提供的预测蛋白质的理化性质,如分子质量、等电点、 氨基酸组成、摩尔消光系数、重组产物在细菌、酵母和哺乳动物细胞中的半衰期、在溶液中的稳定性等; 利用M o tifScan 预测一级结构中糖基化、脂酰化、磷酸化、等修饰位点和模序; 利用Target P分析亚细胞定位序列等特征序列,包括: 分泌信号肽( S ignalP)、质体( Ch loro P)、线粒体(M ITOPROT)、过氧化物酶体等; 利用In terPro Scan 扫描一级结构中包含的结构和功能域特征序列; 利用Pred ict Prote in 预测氨基酸序列的跨膜区和拓扑结构以及二级结构、分子的亲水性、溶液中的分子形态等。

将获得的猪带绦虫un i gene 进行B lasrx 分析,获得编码猪带绦虫EF-1基因的质粒。根据已获得的编码序列,利用DNAC lub 和PCRdesign 软件设计引物。带Nde1酶切位点及带XhoI酶切位点引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以猪带绦虫成虫cDNA文库 EF-2的质粒为模板,应用上述设计的特异引物扩增目的基因,PCR产物10 g /L琼脂糖凝胶电泳鉴定回收。

将PCR 产物和原核表达质粒pET-28a( + )用Nde1和XhoI进行双酶切后回收,连接、转化大肠埃希菌BL-21 /DE3感受态细胞,卡拉霉素筛选阳性单克隆,提取的重组质粒进行双酶切、PCR 和 DNA测序鉴定后进行原核表达。

该基因是延伸因子-2的同源基因,是较保守的基因,与GeneBank中细粒棘球蚴( E ch inococcus granu lo sus) 同源性最高,其一致性可达99%,相似性达99%。从比对结果来看,该克隆基因的5􀀁端序列长于细粒棘球蚴完整的 EF-1序列,推测该基因全长编码序列,其最大的ORF就是其完整的编码区。该基因全长1 657 bp,编码区为第186 bp ~ 1 533 bp,编码448个氨基酸,在5'端和3'端都有非翻译区。

猪带绦虫EF-1基因的理论分子量为49 011.5 Da。假设形成2对二硫键时,280 nm 处的摩尔消光系数为34 170M ^-1 cm^-1,0.1% 浓度( 1 g /L)的Abs为 0.697; 假设二硫键全部打开时,280 nm 处的摩尔消光系数为 33 920M ^-1 cm^-1,0.1% 浓度( 1 g /L) 的Abs为0.692。当成熟肽N 端的一个氨基酸为蛋氨酸时,在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰期为30 h,在酵母和大肠埃希菌中体内表达的半衰期分别大于20 和10 h。在溶液中的不稳定指数为 27.57,低于域值40,在溶液中性质很稳定。

膜序(M o tif)分析结构相似,EF-1蛋白含有5 个潜在的蛋白激酶磷酸化位点,3 个潜在的酪蛋白激酶Ⅱ ( CK2) 位点等。未发现线粒体、过氧化酶体、溶酶体和细胞核等亚细胞定位序列。

预测结果显示: EF-1 为非跨膜蛋白。Sec 预测􀀁 螺旋( H )、α 折叠 ( E) 和无规卷曲( L) 的比例分别是21.21: 31. 70: 47. 10,该蛋白以无规则卷曲为主。

图 1

注: M: DNA标准( DL2000) ; 1: PCR产物; 2: 重组质控双酶切; 3: 质控双酶切。 图 1 重组质粒的PCR和双酶切鉴定

将重组质粒进行PCR 和双酶切鉴定,产物行10 g / L琼脂糖凝胶鉴定。第1泳道为注: M: DNA标准( DL2000) ; 1: PCR产物; 2: 重组质控双酶切; 3: 质控双酶切。 图 1重组质粒的PCR和双酶切鉴定 PCR结果,出现条带位置大约与目的基因1 347 bp大致相符; 第3泳道为双酶切结果,可以看到质粒被切成两条带,下边条带位置与目的基因相符。以上证明重组质粒构建成功。

利用分子生物学方法研究猪带绦虫各基因的结构与功能,可以掌握其致病、免疫、代谢、生理、进化等各方面的规律且避免实验的盲目性。研究表明,延伸因子-1( EF-1)是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质,在基因表达、翻译过程中起重要作用^〔5〕。EF-1可能由α、β、γ、 δ四个亚基组成,其中EF-1 α属于G 蛋白家族,它和氨酰 tRNA、GTP一起组成复合体,通过正确地识别mRNA 上的密码子和tRNA 上的反密码子,负责转运氨酰tRNA到80S核糖体,并具有低水平GTP酶的活性^{〔6, 7, 8〕}。

对猪带绦虫EF-1基因的结构和功能进行全面的生物信息学预测分析后得到以下结果: 首先,通过B lastx 从猪带绦虫成虫cDNA 质粒文库中识别出一个编码EF-1的全长基因,且该基因的二级结构基本上以无规则卷曲为主; 其次,EF-1拓扑结构表明它不是一个膜蛋白; 再次,EF-1 的分子中没有信号肽,提示它一般不会分泌到细胞外; 不具有线粒体、 过氧化酶体、质体、溶酶体等亚细胞定位序列,提示可能是胞浆蛋白。

本研究在生物信息学预测EF-1 的的结构和功能之外,成功构建了猪带绦虫EF-1原核表达载体。在下一步的实验中,还可以对其进行诱导表达及免疫学功能的研究,为掌握该酶在致病、免疫、代谢、生理等各方面的规律,和寻找有开发价值的绦、囊虫诊断、疫苗以及药物靶标抗原基因提供更加完善的理论基础。