中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (1): 68-70   PDF    
引用本文
肖敏, 冯彦红, 董缪武, 吴博, 刘重斌. 锌对慢性酒精中毒肝损伤再生影响[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(1): 68-70.
XIAO Min, FENG Yan-hong, DONG Miao-wu, et al. Effects of zinc supplementation on liver regeneration in mice exposed to long-term ethanol administration[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(1): 68-70.
锌对慢性酒精中毒肝损伤再生影响
肖敏1, 冯彦红2, 董缪武2, 吴博1, 刘重斌1     
1. 温州医学院实验动物中心, 浙江 温州 325035;
2. 温州医学院基础医学院
收稿日期: 2010-09-02.
基金项目: 浙江省科技厅基金(2009F80004);浙江省自然科学基金(Y2080613)
作者简介: 肖敏(1966- ),女,浙江温州人,实验师,大学毕业,主要从事动物微量元素代谢生理研究.
通讯作者: 刘重斌,E-mail:liuchongbin1971@126.com
摘要: 目的 探讨锌对慢性酒精中毒肝损伤再生的影响.方法 健康成年雄性C57BL6小鼠40只,随机分为对照组、慢性酒精中毒、酒精中毒+锌及对照+锌4组,持续喂养6个月,形成慢性酒精中毒模型性肝病.测定血清和肝组织中锌和铁含量以及谷丙转氨酶(ALT)活性,免疫组织化学检测增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定肝细胞核4α因子(HNF-4α)mPNA的表达变化.结果 慢性酒精中毒小鼠肝组织锌含量为(6.83±0.82)μmol/L,明显减少,低于对照组的(15.71±1.63)μmol/L(P<0.01);与对照组ALT活性[(26.2±1.4)U/L]比较,慢性酒精中毒组ALT活性[(60.5±16.8)U/L]升高(P<0.05);补锌进一步增加了PCNA阳性细胞的数目,HNF-4 mRNA水平因酒精而明显减弱.结论 补充锌能够增强慢性酒精中毒小鼠肝再生,其机制与肝细胞核4α因子(HNF-4α)的增加有关.
关键词: 慢性酒精中毒     肝损伤     肝再生     锌    
Effects of zinc supplementation on liver regeneration in mice exposed to long-term ethanol administration
XIAO Min1, FENG Yan-hong2, DONG Miao-wu2, et al     
Center of Experimental Animal, Wenzhou Medical College Wenzhou 325035, China
Abstract: Objective To examine whether dietary zinc supplemen tation could improve liver regeneration in a mouse model of a lcoholic liver disease.Methods Adult C57BL 6 mice were fed with ethanol-containing liquid diet for 6 months to induce a lcoholic liver disease ascertained by serumalanine tran sfera seactivity and histopathological changes.At the same time, the number of proliferation nuclear antigen(PCNA)-positive cell and the expression of hepa to cyte nuclear factor-4a(HNF-4a) were measured.Results Zinc supplementation to ethano-l exposed mice enhanced liver regeneration by increasing the number of proliferation nuclear antigen(PCNA)-positive cell.Zinc-enhanced liver regeneration was associated with an increase in HNF-4a.Conclusion The studyprovides evidence that zinc supplementation enhances liver regeneration at least in part by HNF-4a through the up-regulation of cell proliferation-related proteins, suggesting that dietary zinc supplementation may have beneficial effects in a lcoholic liver disease.
Key words: chronic alcoholism     liver lesion     liver regeneration     znic    

锌是人体内最重要的微量元素之一。饮食缺锌与各种生理缺陷有关,包括食欲不振,皮肤病灶和生长迟缓等〔1, 2〕。研究表明,长期摄入酒精后肝的再生能力会被损害〔3, 4〕。肝细胞核因子4A (HNF-4A),一种锌指蛋白,是肝中丰富的转录因子,参与大多数肝细胞的功能,包括细胞增殖〔5, 6〕。但锌在肝再生中的具体作用,以及锌与慢性酒精性肝病锌指转录因子HNF-4A可能存在的关系尚未确定。本实验通过构建慢性酒精中毒小鼠模型,探究锌对肝损伤后再生影响,锌与HNF-4A之间的关系以及HNF-4A在肝再生中的作用,为酒精性肝病的治疗提供理论依据,开拓治疗的新途径。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

AA320CRT/N原子吸收分光光度计(杭州科晓化工仪器设备有限公司);DLYMPUS1AU-2700全自动生化分析仪(成都迈克科技有限责任公司);多克隆兔抗增殖细胞核抗原(武汉博士德生物工程有限公司);肝脏HNF-4A及内参β-actin的引物(美国Inv itrogen公司);总核糖核酸RNA提取试剂T rizo l (美国Inv itrog en公司);逆转录试剂盒(美国Prom ega公司);Taq酶(美国Takara公司)。

1.2 实验动物

健康成年雄性C57BL6小鼠(温州医学院实验动物中心)40只(25±0.6) g,动物使用许可证:浙22-005234。动物随机分为4组(每组10只),对照组、酒精中毒组、酒精中毒+锌组和对照+锌组。饮水中乙醇含量(%,W/V)逐渐增加,开始为3.1%,每1个月增加013%,最终达到41 6%。在饮水中加入硫酸锌(ZnSO4)75 mg/L。实验期间各组小鼠单笼喂养,自由饮水和进食,持续喂养6个月。每天和每周分别记录食物的摄入量和体重。

1.3 实验方法 1.3.1 锌和铁含量测定

摘眼球取血并分离血清,置4e保存。肝组织先测湿重,用硝酸和过氧化氢冻干并消化肝组织后,再用盐酸溶解稀释。采用火焰原子吸收分光光度法测定血清和肝组织中锌和铁元素含量。

1.3.2 肝损伤检测

应用全自动生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶(ALT)活性。肝组织先固定在10%福尔马林中,采用常规的石蜡切片,苏木素-伊红(H E)染色观察。

1.3.3 肝再生评估

用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色,来评估肝再生情况。肝组织切片微波炉抗原修复后,采用常规的链霉卵白素-生物素(SAB)法染色观察。多克隆兔抗PCNA被用作一抗,在4 ℃过夜培养。磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。PCNA阳性细胞可显示颗粒状和弥漫性两种类型核着色,每张切片高倍镜(×400)下计数1 000个肝细胞PCNA阳性细胞数,以百分率表示。

1.3.4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测

肝脏HNF-4A的引物序列(上游:5'-GATGCTTCTCGGAGGGTCTG-3‘下游:5'-TGGCTTCTTGCTTGGTGAT-3‘),扩增长度:580 bp;内参B-actin引物序列(上游:5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3‘下游:5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3‘),扩增长度:191 bp,RT-PCR法反应条件:94℃预变性3m in,94 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72℃延伸35 s,循环28次,最后72 ℃延伸7 m in。

1.4 统计分析

采用SPSS131 0统计软件进行分析,所有数据都表示为平均值€x±s标准差,经方差分析和Newm an-Keuls.多重比较,P < 0.05认为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组小鼠体重比较(表 1)
表 1 各组动物体重比较( g, …x ± s)

12周之前,各组动物之间无明显差异。而12周之后,慢性酒精中毒组体重明显低于其他3组动物(均P < 0.05)。各组动物食物的摄入量无明显差异。

2.2 锌和铁元素含量及ALT活性(表 2)
表 2 血清和肝组织中锌和铁元素含量及ALT活性

在酒精中暴露6个月可以引起肝中锌浓度的明显减少(P < 0.01),但血清中锌浓度变化不明显(P > 01 05)。饮水中补锌未提高基础水平,但可以预防酒精引起的肝中锌浓度的减少。同时,慢性酒精中毒可引起血清和肝中铁浓度的明显增加(均P < 0.05)。血清中ALT活性有部分被补充的锌抑制,而慢性酒精中毒则可明显升高其活性(P < 0.05)。

2.3 酒精性肝损伤(图 1)
图 1 酒精性肝损伤病理变化

组织病理变化显示,慢性酒精中毒组(图 1C)与正常组动物(图 1A)比较,肝组织损伤明显,可见大滴性脂肪变性,肝细胞坏死,白细胞浸润。这些组织病理学的改变因为补锌而有所减弱(图 1B和D)。

2.4 肝细胞增殖(图 2)
图 2 PCNA 免疫组织化学染色

对照组PCNA阳性细胞的数量为(0.48±0.36)(图 2A),对照+锌组为(0.59±0.4)(图 2B),慢性酒精中毒增加了肝脏中PCNA阳性细胞的数量(2. 68±0.54)(图 2C),但补锌进一步增加了PCNA阳性细胞(28.56±7.21)(图 2D)。

2.5 HNF-4AmRNA水平(图 3)
注: A: 对照, B: 对照+ 锌, C: 酒精组, D: 酒精+ 锌, M: M arker。 图 3 HNF-4mRNA 水平测定

对肝中的HNF-4A mRNA水平测定显示,在一些肝细胞核中,HNF-4A mRNA水平因酒精而显著减弱,但补锌会抑制此作用。

3 讨论

研究表明,长期摄入酒精影响肝再生的进程。与细胞周期相关的蛋白质,包括周期蛋白D1、D3,cdk-1和p53的诱导均被乙醇所抑制,而氨基端激酶(JNK)可被肝部分切除术或细胞生长因子,如表皮生长因子,胰岛素,肝细胞生长因子(HGF)和肿瘤坏死因子(TNF)所诱导〔7, 8〕。

本研究结果显示,酒精性肝损伤与肝脏缺锌密切相关,补锌不仅补充肝脏锌含量,而且还增强了肝再生。增强的肝脏再生能力同肝中HNF-4A的储存量有关。它是通过维持HNF-4α的活性来调节细胞中与增殖相关蛋白质而实现的。研究表明,酗酒的慢性疾病患者与控制饮酒的慢性病患者相比较,其细胞凋亡指数和细胞增殖数均较高,表明肝损伤可以诱导肝细胞增殖〔9〕。而细胞增殖数目少于细胞凋亡数目,则表明肝细胞凋亡与细胞增殖之间存在不平衡。本实验结果显示,暴露于乙醇6个月的小鼠有较多数量的PCNA阳性肝细胞,ALT活性有明显下降。表明长期摄入酒精的确会诱导肝细胞增殖,但并不足以弥补由酒精引发的肝损伤,补锌可以增强小鼠再生肝细胞数。

参考文献
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