中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (1): 57-58   PDF    
引用本文
陈琛, 王中强, 柳楠, 刘雯静, 李婧, 薛文仲, 张伶, 杜昕颖, 邱少富, 王勇, 黄留玉, 李承毅, 宋宏彬. 疑似霍乱弧菌鉴定及分子分型检测[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(1): 57-58.
CHEN Chen, WANG Zhong-qiang, LIU Nan, et al. Characterization and molecular typing of suspected Vibrio cholerae isolates[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(1): 57-58.
疑似霍乱弧菌鉴定及分子分型检测
陈琛, 王中强, 柳楠, 刘雯静, 李婧, 薛文仲, 张伶, 杜昕颖, 邱少富 , 王勇, 黄留玉, 李承毅 , 宋宏彬    
中国人民解放军疾病预防控制所应急大队, 北京 100071
收稿日期: 2010-06-30.
基金项目: 国家科技重大专项(2008ZX10004-0082009ZX10004-2052009ZX10004-315);国家自然科学基金(81001267/H2609)
作者简介: 陈琛(1982- ),女,山东泰安人,硕士在读,主要从事肠道传染病预防控制工作.
通讯作者: 邱少富,E-mail:qiushf0613@hotmail.com;
李承毅,E-mail:Licy-60@163.com
摘要: 目的 对北京市某医院肠道门诊2株疑似霍乱弧菌进行鉴定,检测其主要毒力基因,并分析其基因型别特征.方法 利用细菌生化鉴定条(API 20 E)进行生化鉴定,玻片凝集法确定其血清型别,应用PCR及测序技术分析其16 S rRNA基因;PCR检测其8个主要毒力基因,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析其基因型别.结果 经鉴定,该2株疑似霍乱菌株均为非O1非139群霍乱弧菌,经16 SrRNA分析与美国国家生物技术信息中心数据库中霍乱弧菌相似性达100%,均包含毒力基因hylA、ompW和toxR,PFGE结果显示2株菌具有完全不同的带型.结论 2株疑似霍乱弧菌为非O1非139群霍乱弧菌,其致病因素与(hylA)、(ompW)、(toxR)毒力基因有关,并且2株菌遗传关系较远.
关键词: 霍乱弧菌     毒力基因     脉冲场凝胶电泳    
Characterization and molecular typing of suspected Vibrio cholerae isolates
CHEN Chen, WANG Zhong-qiang, LIU Nan, et al    
Institute of Disease Control and Prevention, Academy of Military Medical Sciences Beijing 100071, China
Abstract: Objective To identify two suspected Vibrio cholerae isolates from patients with intestinal diseases diagnosed in a hospital in Beijing city and to detect their main virulence genes and analyze their genotypes.Methods The suspected V.cholerae isolates were identified with API 20E strips,serotype and 16S rRNA analysis.PCR was used to detect the distribution of the eight major virulence genes,and the genetic association was measured with pulsed-field gel electrophoresis(PFGE).Results The two suspected V.cholerae isolates were confirmed as non-O1/non-O139 V.cholerae.16SrRNA analysis showed that the two isolates was 100% homologous to those from NCB I database.Virulence geneshy Al, omp W and toxR were detected.The two strains showed different banding patterns with PFGE.Conclusion The two suspected strains were identified to be non-O 1/non-O 139 V.cholera and the pathogenic factors may be related to the virulence geneshy Al,ompW and to xR.The two strains were distant in evolutionary relationship.The result indicates that different types of non-O 1/non-O 139 V.cholera exist in the city.
Key words: Vibrio cholerae     virulence gene     pulsed-field gel electrophoresis    

霍乱弧菌根据菌体抗原不同可分为> 200个的O 型血清群,O 1群和O 139群霍乱弧菌可引发霍乱流行。非O 1非 O 139 霍乱弧菌血清群可引起霍乱样腹泻、一般腹泻或肠道外感染,一般为散发病例。印度新德里也曾有O 10型霍乱弧菌引起的聚集性病例,中国浙江省有报道过非O 1型霍乱弧菌引起聚集性食物中毒〔1〕,表明非O 1 非O 139 群霍乱弧菌也可引起感染性腹泻的局部暴发流行。2010年6月,北京某医院肠道门诊分离出2株疑似霍乱弧菌,未鉴定出血清型,后将疑似标本送交中国人民解放军疾病预防控制中心实验室进行进一步生化、血清分型及16S rRNA 种属鉴定,并对其毒力基因与基因型进行分析。现将实验室检测结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

北京某医院肠道门诊自腹泻病人粪便标本中分离得到2株疑似霍乱弧菌,分别命名为V 3071、V 3072。实验室保存的2株O 1群埃尔托型菌株作为对照,编号为Lab 1、Lab 2。

1.1.2 试剂

细菌基因组DNA 提取试剂盒( 北京天根公司) ,碱性蛋白胨水、双糖铁培养基(北京陆桥生物公司); 细菌生化鉴定条( 法国梅里埃生物公司( API 20 E) ); Ex Taq DNA 聚合酶(大连宝生物公司)。O 1、O 139群霍乱弧菌诊断血清(兰州生物制品研究所),蛋白酶K(德国M ERCK公司),PFGE琼脂糖( 美国SeaKem Go ld公司) 。

1.1.3 仪器设备

TC-412 PCR 扩增仪(英国TECHNE 公司)、DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂)、Gel Doc 2000 (美国B io-Rad 公司) 凝胶成像仪、CHEF-MAPPER 脉冲场电泳仪(美国B io-Rad公司)。

1.1.4 引物

参照文献〔2, 3, 4〕合成引物。

1.2 方法 1.2.1 生化鉴定

将分离到的菌株转种营养琼脂平板,37 ℃ 培养18~ 24 h,挑取单个菌落接种于双糖铁斜面。无菌棉签刮取琼脂平板上的菌落,用生理盐水稀释至浓度为0.5麦氏单位,接种于API 20 E生化鉴定条,37 ℃ 恒温孵箱培养20 h。

1.2.2 血清鉴定

使用O 1群和O 139 群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集鉴定,同时以生理盐水作阴性对照。

1.2.3 16 S rRNA 鉴定

试验菌株接种于碱性蛋白胨水,37 ℃ 培养16 h,吸取1 mL菌液,采用天根公司细菌DNA 提取试剂盒制备模板,-20 ℃ 冰箱保存备用。16 S rRNA 的PCR 产物利用引物进行双向测序,测序由中科西林公司完成。测序结果所得序列用DNASTAR ( SEQMAN) 软件剪切拼接,所得结果与美国国家生物技术信息中心( NCB I) 数据库中已有序列进行比对,并下载与4株实验菌株同源性较高的序列,用DNASTAR (MEGALIGN) C lustalW M ethod方法进行系统发生分析。

1.2.4 毒力基因检测

应用PCR技术对8个毒力基因hy-lA、tcpAET、ompW、ctxA、zot、ace、tcpACL、toxR 进行扩增。反应条件为95 ℃ 5 m in预变性,然后95 ℃ 30 s,56 ℃ 45 s,72 ℃45 s,30个循环,最后72 ℃延伸5 m in。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,以DL 2000 DNA M a rker作参照,经溴化乙锭染色,凝胶成像仪读取结果。

1.2.5 脉冲场凝胶电泳( PFGE)

按美国疾病预防控制中心 Pu lseNe t提供的标准实验方案〔5〕进行操作。

2 结 果 2.1 生化反应

API 20 E生化鉴定条结果编码为5107124,与霍乱弧菌符合率为99.9%。分解葡萄糖不分解乳糖,动力实验阳性、氧化酶、制动实验均为阳性。2株分离菌株的生化反应符合典型霍乱弧菌生化特性。

2.2 血清学鉴定

将2株分离菌株用O 1群及O 139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集反应,结果均未出现凝集现象,鉴定为非O 1非O 139群霍乱弧菌。

2.3 16 S rRNA 种属鉴定

经过16 S rRNA 保守基因PCR扩增、产物测序及序列比对分析后,与NCB I数据库中霍乱弧菌相似性可达100%。而核苷酸序列相似性在97%以上就可以视为同一种属〔6〕。其中分离株V 3071与数据库中编号为RC 395、RC 549的霍乱弧菌的相似性为100%,与SIO、V 100 相似性为99%。V 3072与数据库中血清型为O 395、O 1的序列、以及编号为KK 3的霍乱弧菌相似性为100%,与RC 466、 ATCC 14035、LD 081008 B 1相似性为99%。

2.4 毒力基因检测(图 1,2)
注: 1~ 4: hylA; 5~ 8: tcpAET; 9~ 12: ompW; 13 ~ 16: ctxA; 菌株顺 序: Lab1、Lab2、V3071、V3072。 图 1 hy lA、tcpAET、ompW、ctxA 4个毒力基因电泳结果

注: 17~ 20: zot; 21~ 24: ace; 25 ~ 28: tcpACL; 29 ~ 32: toxR; 菌株 顺序: Lab1、Lab2、V3071、V3072。 图 2 zo t、ace、tcpACL、toxR 4个毒力基因电泳结果

2株非O 1非139霍乱弧菌在基因溶血素( hy lA )、外膜蛋白质( ompW )、毒素表达调控蛋白 ( toxR ) 位点表现为阳性,其余位点tcpACL、ctxA、zo t、ace、tcpAET均为阴性。

2.5 脉冲场凝胶电泳( 图 3)
注: M: H 9812; 1: V3072; 2: V3071; 3: Lab2; 4: Lab1。 图 3 4 株霍乱弧菌PFGE电泳图谱

脉冲场凝胶电泳PFGE结果显示本次分离的2株非O 1非O 139霍乱弧菌带型不相同,与对照O 1型霍乱弧菌亦不相同。

3 讨 论

本研究通过生化反应和血清凝集将2株疑似霍乱弧菌鉴定为非O 1非O 139霍乱弧菌,16S rRNA 分析进一步在分子水平上验证了表型鉴定结果。目前发现的非O 1非O 139群霍乱弧菌致病因子大部分与O 1群或者O 139群霍乱弧菌相似,表明霍乱弧菌毒力岛可以水平传播〔7〕,增加了非O 1 非 O 139群霍乱弧菌向烈性传染性病原菌变异的可能性,是一个潜在的病原微生物库,需要加强监测。

霍乱弧菌致病因子中霍乱毒素( CT ) 和毒素共调菌毛 ( TCP)为最主要的致病因素,具备这2种致病因子的霍乱弧菌成为产毒株,反之为非产毒株〔8〕。有文献表明,只有5% 的非O 1非O 139霍乱弧菌携带tcpA基因〔9〕。本研究的2株霍乱弧菌对ctxA 和tcpA 2个主要的毒力基因均缺失,符合非O 1非O 139霍乱弧菌的特性,而这2株霍乱弧菌的致病因素可能与hylA、ompW、toxR 有关。

PFGE结果显示2株非O 1非O 139霍乱弧菌分为2 个不同带型,遗传关系较远,说明2位患者的感染途径与传染源不同。这表明在北京市可能存在不同的非O 1非O 139霍乱弧菌传染源,在一定条件下会引起感染性腹泻的局部暴发,这对公共健康构成了潜在的威胁,这提示应加强传染病病原监测及其流行病学规律研究。

参考文献
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