中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (1): 50-51   PDF    
引用本文
高春鹏, 仲来福, 任翔, 姜丽平, 耿成燕, 姚晓峰, 曹军. 线粒体DNA缺失和功能缺失对核基因影响[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(1): 50-51.
GAO Chun-peng, ZHONG Lai-fu, REN Xiang, et al. Effects of mitochondrial DNA-depletion and functional deficiency on expression of nuclear DNA[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(1): 50-51.
线粒体DNA缺失和功能缺失对核基因影响
高春鹏, 仲来福, 任翔, 姜丽平, 耿成燕, 姚晓峰, 曹军     
大连医科大学卫生学教研室, 辽宁 大连 116044
收稿日期: 2010-06-27.
基金项目: 国家自然科学基金(30771820);辽宁省高等学校科研计划项目(2008157)
作者简介: 高春鹏(1984- ),男,吉林长春人,硕士在读,主要从事生化与分子毒理学研究.
通讯作者: 曹军,E-mail:caojunly@163.com
摘要: 目的 探讨线粒体DNA(mtDNA)缺失和线粒体功能缺失对核基因表达的影响.方法 应用人全基因组芯片分别对mtDNA缺失、线粒体功能缺失及正常HepG2细胞的核基因表达谱进行生物信息学分析.结果 与正常HepG2细胞比较,核基因表达差异倍数>2倍的m tDNA缺失细胞共有5 489个,其中3 350个上调,2 139个下调;而线粒体功能缺失细胞共有3 334个,其中1 457个上调,1 877个下调;mtDNA缺失和线粒体功能缺失对细胞信号途径均有明显影响,与正常HepG2细胞比较,线粒体功能缺失时信号途径差异明显的有334个,mtDNA缺失时信号途径差异明显的有188个.结论 mtDNA缺失和线粒体功能缺失对核基因表达均有明显影响,mtDNA缺失对核基因表达的影响比功能缺失的影响更大,其可能机制在于对不同信号途径的影响.
关键词: 线粒体DNA缺失     线粒体功能缺失     核基因表达     人全基因组芯片    
Effects of mitochondrial DNA-depletion and functional deficiency on expression of nuclear DNA
GAO Chun-peng, ZHONG Lai-fu, REN Xiang, et al     
Department of Hygiene, Dalian Medical University Dalian 116044, China
Abstract: Objective To study the effects of mitochondrial DNA(mtDNA)-depletion and mitochondrial functional deficiency on the expression of nuclear DNA.Methods Using human whole-genome chip,the expression profiles of nuclear DNA in mtDNA-depleted HepG2 cells and mitochondrial function deficient HepG2 cells were analyzed.Results Among 41 000 genes,there were 5 489 genes differentially expressed in mtDNA-depleted HepG2 cells compared with normal HepG2 cells(the fold change≧2.0),with 3 350 up-regulated and 2 139 down-regulated.In mitochondrial function de ficient HepG2 cells, there were 3334 genes differentially expressed, with 1457 up regulated and 1877 down regulated.The effects of mtDNA depletion and mitochondrial function deficiency on cell signaling pathways were significantly different and imposed different effects on different signaling pathways.Conclusion Both mtDNA depletion and mito chondrial function de ficiency induce significant different expression of nuclear DNA.The effect of mtDNA depletion ismore serious as compared with that of mitochondrial function deficiency.The mechanism may underlie the different effects on different signaling pathways.
Key words: mitochondrial DNA depletion     mitochondrial function deficiency     nuclear DNA expression     whole human genome oligo microarray    

线粒体是细胞进行有氧代谢的场所,在各种致病因素作用下线粒体极易出现各种结构和功能损伤[1]。线粒体DNA ( mitochondrical DNA,mtDNA ) 是惟一存在细胞核以外的遗传物质,是线粒体蛋白质合成所必需[2]。mtDNA 极易受到活性氧的攻击,而产生氧化性损伤[3]。前期研究发现,姜黄素对 HT-29细胞的m tDNA 和核DNA ( nDNA )损伤均呈剂量依赖关系,并且对m tDNA 的损伤作用明显大于nDNA[4],表明 mtDNA损伤可能是导致细胞功能改变的根源。为探讨mtDNA 缺失和线粒体功能缺失对核基因表达的影响,本研究采用人全基因组芯片分析m tDNA 缺失HepG2细胞和线粒体功能缺失H epG2细胞中nDNA 的表达情况。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

羰基氰4-(三氟甲氧基)苯腙、溴化乙锭( EB) (美国Sigm a 公司); TR Izol 试剂、胎牛血清( 美国 GIBCO 公司); 芯片杂交试剂盒、表达谱基因芯片(上海康成生物公司)。CO2 培养箱(美国FORMA 公司)。

1.2 细胞

人肝癌细胞H epG2( 中国协和医科大学,ATCC H B28065)。采用含双抗( 100 U /mL青霉素,100 μg /mL链霉素) 及10%胎牛血清的含非必需氨基酸的最低限度的基本培养基(M EM􀀁NEAA),在37 ℃ 、5% CO2 的培养箱中培养细胞,取处于指数生长期的细胞用于实验。

1.3 细胞处理 1.3.1 m tDNA 缺失的H epG2 细胞制备

参考文献[5],H epG2细胞连续暴露于添加EB ( 50 ng /mL) 、丙酮酸盐( 100μ g /mL)和尿苷( 50 μg /mL) 的培养基中,经过7代培养后,其 m tDNA几乎完全缺失,PCR 测定m tDNA 的含量< 5% 时,进行克隆培养即为m tDNA缺失的H epG2细胞。

1.3.2 线粒体功能缺失的H epG2 细胞制备

参考文献[6] 采用线粒体功能抑制剂羰基氰4-( 三氟甲氧基) 苯腙连续处理H epG2细胞24h,荧光比色法检测线粒体膜电位,确定线粒体功能受损伤,即为线粒体功能缺失的H epG2细胞。

1.4 全基因组表达谱芯片样品制备和检测

用TR Izol试剂分别提取正常H epG2细胞和m tDNA 缺失、线粒体功能缺失 H epG2细胞的总RNA,放入-80 ℃ 冰箱中保存并干冰冷冻送样。芯片杂交和检测由上海康成生物公司完成。

1.5 统计分析

芯片扫描所得数据用Ag ilent GeneSpring GX 10􀀁0软件进行计算和处理,组间比较采用t检验。

2 结 果 2.1 m tDNA缺失和线粒体功能缺失对核基因表达影响 2.1.1 差异表达核基因数目的统计分析

聚类分析显示,m tDNA 缺失和线粒体功能缺失这2 种细胞中核基因的表达与正常细胞比较均有明显变化。与正常H epG2细胞比较,在 41 000个探针池中,m tDNA缺失的细胞基因表达差异倍数> 2倍的有5 489 个,其中上调的有3 350 个,下调的有2 139 个; 而线粒体功能缺失的H epG2细胞基因表达差异倍数> 2 倍的有3 334个,其中上调的有1 457个,下调的有1 877个。

2.1.2 核基因表达差异程度分析( 图 1)
注: A: m tDNA 缺失H epG2细胞和正常对照H epG2细胞比较; B: 线粒体功能缺失的H epG2与正常对照组细胞比较 图 1 基因表达荧光信号比值散点图

采用2组细胞基因表达的荧光信号比值绘制散点图,愈靠近X 轴或Y轴的点则表明该点基因差异表达愈明显。从散点的分布看,A 中比 B 中靠近X 轴或Y 轴的点更多,其离散程度更大,表明m tDNA缺失H epG2细胞和正常H epG2细胞的基因表达差异比线粒体功能缺失H epG2细胞与正常H epG2细胞表达差异更明显。

2.2 m tDNA缺失和线粒体功能缺失对细胞信号途径影响

对上述基因芯片得到的差异表达基因所涉及到的信号途径进行统计分析,结果表明,与正常H epG2细胞比较,m tDNA 缺失细胞中的信号途径差异明显(P < 0.05) 的有315 个,而线粒体功能缺失H epG2细胞,信号途径差异明显( P < 0.05)的有 334个,m tDNA 缺失细胞与线粒体功能缺失细胞比较,信号途径差异明显(P < 0.05)的有188 个,表明m tDNA 缺失和线粒体功能缺失对细胞信号途径均有明显影响,而且它们对不同信号途径的影响又有较大差别。

3 讨 论

本研究结果表明,m tDNA 缺失和线粒体功能缺失对核基因的表达均有影响。线粒体是真核生物中细胞的能源中心。 因此,线粒体功能缺失使细胞失去了原动力,从而诱导核基因的异常表达。m tDNA缺失可能是通过胞浆中某些蛋白质的磷酸化和去磷酸化后进入细胞核而引起nDNA 表达的异常,这种线粒体对核基因表达的调控,称为逆行调控[7]。

本研究发现,m tDNA 缺失对核基因表达的影响比线粒体功能缺失的影响更大。进一步研究结果表明,m tDNA缺失和线粒体功能缺失对细胞信号途径均有明显影响,而且它们对不同信号途径的影响又有很大差别。这些信号途径所包含的基因不同,基因的数量也不同,因此,推测对不同信号途径的影响差异可能是m tDNA 缺失比线粒体功能缺失对核基因影响更大的主要原因。与核基因比较,m tRNA 更容易受到环境因素的影响而发生氧化性损伤[8]。因此,m tRNA 缺失对核基因表达的影响可能是多种疾病发病的主要机制,m tRNA缺失和线粒体功能缺失对不同信号途径的影响有待进一步研究。

参考文献
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