福氏志贺菌是引起细菌性痢疾的重要致病菌,中国每年有大约50万人感染^〔1〕。志贺菌的流行一直以福氏2a血清型为主,而近几年的全国细菌性痢疾监测工作发现福氏4c血清型引发腹泻病例数有明显上升趋势,其中,福氏4c志贺菌在河南、山西、江苏、甘肃、安徽等省已造成大面积流行^{〔2, 3〕}。本研究选择2005-2009年分离自北京地区的44株福氏4c志贺菌,对其生化特征和毒力基因携带情况进行分析。现将结果报告如下。

44株福氏4 c志贺菌分离自2005-2009 年北京市北大医院、解放军302医院和总政门诊部收集的腹泻病人粪便标本。F2a 301标准菌株为本实验室保存。

淋病奈瑟球菌( GN)增菌液、SS琼脂、营养琼脂(北京陆桥技术公司); Ap i20E生化板条(法国生物梅里埃公司);志贺菌属诊断血清(日本生研公司);基因组提取试剂盒(美国prom ega公司); Taq DNA聚合酶、dNTP、Buffer 和100 bpM a rker(大连宝生物公司); PCR引物(上海生工合成) 。试剂均在有效期内使用。

参照Ap i20E生化板条操作说明,将分纯培养菌落稀释至0.5个M cFarland,加入生化板条,37℃孵育 18 h后加入附加试剂,应用Apilabplus软件分析鉴定结果。

使用志贺菌属诊断血清进行玻片凝集试验,并以生理盐水作为对照。

挑取单个菌落接种至GN增菌液,37 ℃振荡培养6 h。取1 mL菌液参照基因组提取试剂盒操作说明提取基因组作模板。应用PCR技术检测该菌株的侵袭性质粒抗原H ( ipaH )、志贺肠毒素1( setlA、setlB编码) 、志贺肠毒素2( sen编码)、侵袭相关位点(ial)和毒力表达调控基因 ( v irF)。引物序列、扩增片段长度、退火温度见参考文献 ^{〔4, 5〕}。选择F2a 301标准菌株对PCR扩增条件进行优化。 50 μL反应体系,包含模板(约50 ng ) 1 μL,上下游引物( 10 μmol)各2 μL,10 × PCR Bu ffer 5 μL,dNTP Mixture 4 μL,rTaq ( 5 U /μL) 0.25 μL,加灭菌蒸馏水至50 μL。PCR反应条件: 94 ℃ 5 m in预变性后,94 ℃ 45 s、X ℃ 45 s、72 ℃ 45 s 30个循环后,72 ℃延伸5 m in( X为退火温度)。反应结束后,各菌株分别从6对引物反应液各取1 μL混匀后加1 μL Load ing Bu ffer,上样至含溴化乙锭( Ethidium bromide,EB)的3%琼脂糖胶,80 V恒压电泳2.5 h。

44株菌生化反应邻硝基苯-半乳糖苷酶、苯丙氨酸脱氨酶、山梨醇发酵、精氨酸双水解酶、VP、鼠李糖发酵、赖氨酸脱羧酶、明胶液化、蔗糖发酵、鸟氨酸脱羧酶、吲哚试验、蜜二糖发酵、柠檬酸盐利用、葡萄糖发酵、苦杏仁苷发酵、硫化氢、甘露醇发酵及阿拉伯糖发酵呈阳性外,其他均呈阴性。

菌株应用志贺菌属血清呈现相同凝集反应谱,其抗原结构式为( Ⅳ: 7,8),即与福氏志贺菌多价血清凝集,与福氏志贺菌Ⅳ型单价血清凝集,与群因子7,8血清凝集。

图 1

注: M: 100 bp marker; 1~ 6: setlA, setlB, sen, ia,l ipaH, virF。 图 1 毒力基因PCR扩增条件优化结果

以F2a 301标准菌株为参照,进行PCR扩增条件优化。

4c志贺菌的6种毒力基因携带情况(图 2)全部菌株共有6种毒力基因型,其中携带全部6种毒力基因的型别为优势毒力基因型。其中ipaH、se tlA、se tlB、sen、ial和 v irF 6种毒力基因携带率分别为100%、97.7% 、100%、 77.2%、72.7%和77.2%。

图 2

注: M: 100 bp m ark er; 1 ~ 19: 编号为1~ 19 福氏4 c志贺菌。 图 2 部分福氏4 c志贺菌毒力基因检测结果

本研究中,北京地区连续5年均分离到该血清型菌株,表明福氏4c志贺菌在北京地区一直存在散发流行。44株福氏 4c志贺菌生化反应稳定、一致。在研究的20项生化反应中,除葡萄糖发酵、甘露醇发酵、蜜二糖发酵和阿拉伯糖发酵为阳性,其他生化反应均为阴性。孙永祥等、庄菱等^{〔3, 7〕}研究表明该型志贺菌均发酵葡萄糖和甘露醇,而蜜二糖和阿拉伯糖的反应结果不定。孙永祥等进一步研究,菌株经20次传代后,部分生化反应不稳定,表明菌株在反复传代过程中酶的活性发生了改变^〔6〕。

研究表明,志贺菌属的致病性是由不同基因编码的几种致病因子决定。主要包括由ia l介导肠细胞黏附力、与ipaH 相关的侵袭力及由setlA、setlB编码的志贺肠毒素1和sen编码的志贺肠毒素2^〔7〕。本研究中,北京地区福氏4c志贺菌 ipaH、se tlA、setlB、sen、ial和v irF6种毒力基因携带率分别为 100%、97.7%、100%、77.2%、72.7%和77.2%,与其他地区福氏4c志贺菌研究中毒力基因携带率相近^{〔8, 9, 10〕},由此可见,福氏4c志贺菌中普遍存在志贺菌主要的毒力基因,且至少携带> 3种毒力基因,而同时携带6种毒力基因的菌株占据全部菌株的54􀀁5%,成为北京地区福氏4c志贺菌优势菌株。

以上结果表明,福氏4c志贺菌在我国多数地区普遍存在,生化特征较为稳定,毒力基因携带率高,致病力强,需继续加强对该血清型志贺菌的监测,及时改进细菌性痢疾的防控措施,防止福氏4 c亚型志贺菌进一步扩散。