活禽市场是禽流感病毒保存的重要场所^〔1〕。国外和中国香港地区已经进行活禽市场禽流感病毒监测^{〔2, 3, 4, 5〕}。珠江三角洲是广东省禽类集散地,又是候鸟的重要栖息场所,人口密度大及流动人口众多,一直是全国乃至世界禽流感防治的高度关注地区^〔6〕。2006年广州市发现1例人感染禽流感病例,在与该病例相关的的9个活禽市场79个活禽笼子中检出H5N1病毒核酸阳性1份^〔7〕,提示病例的感染来源可能来自于活禽市场。为了评价活禽市场传播禽流感的风险,2007年5月-2008年4月,在珠江三角洲7个城市的活禽市场进行了甲型流感病毒核酸监测,并分析了甲型流感病毒核酸高阳性率的影响因素,为防治禽流感和流感提供依据。现将结果报告如下。

2007年5月-2008年4月,选取珠江三角洲深圳市等7个城市42个活禽市场,在每个活禽市场每月至少采集外环境样品(包括笼子、地板、粪便、水渠等)4份,共采集样品3 864份,同时进行活禽市场分布及其管理状况现场调查。

(1)样品采集与现场调查:采用棉签拭子涂抹方法,采集包括笼子、地板、粪便、水渠等外环境样本。使用自制的统一.活禽市场调查表.,由经过统一培训的流行病学医生面对面访问调查活禽市场一般情况以及相关因素,主要包括市场位置、经营情况、管理制度、售卖品种、卫生习惯、卫生设施等;(2)仪器与试剂:MagNA pure LC RNA iso lation kit.high perform ance (Cat:03542394001)核酸提取试剂和全自动核酸提取仪(瑞士罗氏公司);通用A型流感病毒荧光RT.PCR快速检测试剂盒(深圳匹基公司)。

采用M agNA pure LC RNA i.so lation kit.high perform ance核酸提取试剂和全自动核酸提取仪提取拭子液中病毒。采用通用A型流感病毒荧光RT.PCR快速检测试剂盒进行荧光定量PCR (Real-time PCR)检测,反应体系及反应条件参照试剂盒说明书操作。Real-tim e PCR反应条件:42℃30 m in;92℃3 m in;92℃10 s,45℃30 s,72℃1 m in,5个循环,92℃10 s,60℃30 s (收集荧光),40个循环。

(1)阈值设定原则:以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,结果显示阴性为准。(2)结果描述及判定:无荧光强度(Ct)值并且无扩增曲线为阴性,表示样品中无HA流感病毒;Ct值≤30.0,且出现典型扩增曲线为阳性,表示样本中存在HA流感病毒;Ct值> 30.0的样本重做,无Ct值者为阴性,否则为阳性。

以所有调查的活禽市场HA病毒核酸年平均阳性率作为划分标准将年平均阳性率超过此标准的活禽市场作为高阳性率市场,低于这一标准的活禽市场作为低阳性率市场,比较2类市场与相关因素的关系。相关因素包括:市场位置(市区、郊区)、市场离居民区距离(< 1 km、> 1 km)、市场经营时间(每天、定期集市)、市场开放时间(晨市、全天)、场馆情况(封闭、开放)、有无活禽现场宰杀、有无生鲜禽肉交易、有无鸡蛋交易、有无生猪交易、有无生猪肉交易、有无经营鸡、鸭、鹅、鸽子、生鸡肉等、禽类交易方式(批发、零售)、水禽与其他家禽交易区域/档口有无分开、有无建立家禽畜牧检疫准入制度、有无统一收集死禽场所、收集死禽有无登记、市场有无建立休市制度。

采用Excel 2003进行数据录入,采用SPSS 10.0软件进行统计分析,采用2 ×2卡方χ²检验进行分析。

42个活禽市场中,佛山市9个,深圳、珠海市各7个,中山、东莞各6个,江门市4个,广州市3个,均为每天经营,其中市区市场31个,郊区市场11个;早晨市场2个,全天市场40个;市场离居民区< 1 km 33个,> 1 km 9个;封闭式市场36个,露天式市场6个;批发市场7个,零售市场35个。水禽与其他家禽交易区域分开23个,占54.8%,未分开19个,占45.2%;建立畜牧检疫准入制度40个,占95.2%,没有建立2个,占4.8%;有统一收集死禽场所19个,占45.2%,无统一收集场所23个,占54.8%;收集死禽有登记16个,占38.1%,无登记26个,61.9%;建立休市制度7个,占16.7%,未建立休市制度35个,占83.3%。

2007年5月-2008年4月,共检测样品3 864份,检出阳性876份,平均阳性率22.67%。7个城市均有阳性样品检出,阳性率从高到低依次为:广州市32.20%(151/469),东莞市31.55%(183/580),珠海市28.47%(195/685),深圳市24.15%(156/646),中山市22.35%(114/510),佛山市8.57%(42/490),江门市7.23%(35/484)。每个月均有阳性样品检出,其中9月份至次年2月份阳性率高于平均阳性率22.67%。

图 1

图 1 市场外环境HA病毒核酸检测阳性率月份分布

表 1可见,与鸭有关的外环境样品HA病毒核酸阳性率高于其他样品阳性率,表明健康水禽携带HA病毒感染率较高。

表 1

表 1 不同活禽市场外环境甲型流感病毒核酸检测种群分布

表 1 不同活禽市场外环境甲型流感病毒核酸检测种群分布

42个活禽市场HA病毒核酸年检出阳性率为22.67%(876/3 864),据此划分,高阳性率市场16个,低阳性率市场26个。表 2可见,HA病毒核酸高阳性率的影响因素有市场位置在市区、活禽现场宰杀、交易方式为零售等3个主要因素。

表 2

表 2 活禽市场外环境甲型流感病毒核酸检测高阳性率相关因素分析

表 2 活禽市场外环境甲型流感病毒核酸检测高阳性率相关因素分析

甲型流感病毒根据其表面的血凝素和神经氨酸酶分为若干亚型,HA有15个亚型(H 1~H 15),NA有9个亚型(N1~N 9),其中甲型危害大,宿主范围也很广泛,从禽和人、猪、马等哺乳动物中均能分离到^〔8〕。中国香港和大陆对人禽流感病例进行的病例对照研究均表明,暴露活禽市场是危险因素^{〔8, 9〕}。本研究对珠江三角洲7个城市42个活禽市场连续1年的甲型流感(HA)病毒核酸监测结果显示,活禽市场外环境HA核酸阳性率为22.67%,并且所监测的每个城市和每个市场均可检出阳性,表明活禽市场检出HA核酸比较普遍。9月份至次年2月份活禽市场外环境HA核酸阳性率较高,与人感染高致病性禽流感的高发季节一致^〔10〕。结果还显示,与鸭有关的外环境样品的阳性率较高。研究表明,鸭可以表面健康但携带病毒,并且不断向环境排毒,从而感染鸡等其它禽类,增加了禽流感感染人类的可能性^〔11〕。广东省在追溯首例禽流感病例感染来源时,从禽类肛拭子检出禽流感病毒核酸^〔12〕。广州市疾病预防控制中心在某肉菜市场H 5N1型动物禽流感疫情暴发后调查人群感染禽流感病毒(AIV)的风险,发现家禽屠宰人群H 9抗体阳性率比其他食物零售人员要高^〔13〕。提示人群通过活禽市场感染普通流感和人感染禽流感的风险较高。

美国纽约和新泽西州的监测结果表明,市场1周开放7 d和卖野兔是危险因素,每周关闭> 1 d,每天清洁和消毒是保护因素^〔3〕;中国香港对活禽市场"休市日"的效果评估研究表明,休市日明显减少了市场禽流感病毒(H9N2)的分离率^〔2〕。提示要从根本上控制市场活禽类携带病毒,预防引起人感染的首要措施是科学管理市场。本研究对活禽市场HA核酸阳性率的影响因素分析结果表明,市场位置在市区、有活禽现场宰杀、零售的交易方式等也是危险因素。提示珠江三角洲地区防止人群暴露于活禽市场,从而可能感染禽流感的控制环节在于减少活禽现场宰杀,提倡"白条禽"上市,将宰杀场所尽量远离市区。