赭曲霉毒素(ochratox in)是曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生的二级代谢产物,有A、B、C、D 4种化合物,其中毒性最强的是赭曲霉毒素A (ochra toxin A,OTA),它在农作物中污染水平高,分布广,与人类健康关系密切。研究表明,OTA不仅具有免疫毒性、肾毒性和肝毒性,还有致畸、致突变和致癌作用^〔1〕。因此,研究OTA与DNA的相互作用,对探讨OTA的毒害作用机制有重要意义。国外研究两者的相互作用多采用32 P标记法^〔2〕。本研究利用紫外光谱法和荧光光谱法探讨 OTA与小牛胸腺DNA和鲑鱼精DNA的相互作用。

UV-2200紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);970CRT荧光分光光度计(上海仪器有限公司);鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA、OTA (美国Sigma公司)。

鲑鱼精DNA和小牛胸腺DNA分别配制成 200 μg/mL的溶液,于0~4℃保存。OTA用3%的NaHCO₃溶液配制成40 μg/mL的溶液。磷酸缓冲溶液pH 7.0(浓度 0.1 mol/L)。实验用水为二次蒸馏水。将不同浓度的DNA与OTA溶液相混合,加入磷酸缓冲溶液,避光放置,所有测量均在室温下进行。

分别配制浓度为 10 μg/mL的OTA、30 μg/mL的小牛胸腺DNA和OTA与小牛胸腺DNA的混合溶液,混合溶液中两者的浓度与上述相同。分别扫描OTA、小牛胸腺DNA和两者混合溶液的紫外光谱,波长范围是190~500 nm。在固定OTA浓度10.0 μg/mL的情况下,进一步考察鲑鱼精DNA浓度为0.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0,60.0,70.0 μg/mL和小牛胸腺DNA浓度为0.0,15.0,30.0,45.0,75.0,90.0 μg/mL混合溶液的紫外吸收光谱。

扫描此溶液的荧光光谱,波长范围是200~600 nm,激发波长383 nm。激发单色器狭缝5 nm,发射单色器狭缝10 nm。在固定OTA浓度为 10 μg/mL情况下,分别研究了不同浓度的鲑鱼精DNA和小牛胸腺与OTA混合溶液的荧光光谱。在固定OTA浓度为10 μg/mL情况下,分别研究了鲑鱼精DNA浓度为0.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0 μg/mL和小牛胸腺DNA浓度为0.0,20.0,40.0,60.0,80.0,100.0 μg/mL与OTA混合溶液的荧光光谱。

图 1

注: 0.1mol/L磷酸缓冲溶液: pH 7.0。 图 1 不同浓度鲑鱼精DNA 与OTA的紫外吸收光谱

分别考察了 OTA、小牛胸腺DNA及两者混合溶液的紫外吸收光谱。结果表明,在383 nm处,DNA没有吸收峰,OTA单独存在时紫外吸收峰值与等量OTA和小牛胸腺DNA混合溶液中的峰值基本一致。混合溶液在220及260 nm处的吸收峰值与两者单独存在时吸收峰值之和基本相等。在383 nm处OTA的紫外吸收峰以及吸收波长基本不变,表明OTA的结构随着DNA浓度的增加并未发生改变。而在220和260 nm处,DNA与 OTA的吸收峰却逐渐增加,这是由于DNA浓度逐渐增大,致使此吸收峰增强。由以上紫外吸收图谱可以看出,DNA与 OTA未相互作用。

图 2

注: 0.1mol/L磷酸缓冲溶液: pH 7.0。 图 2 不同浓度小牛胸腺DNA 与OTA 的荧光光谱

实验表明,随着DNA浓度的增加,OTA的荧光强度以及吸收峰位置不变,表明OTA和DNA在混合溶液中独立存在,相互之间未发生结合作用。

DNA加合物的形成被认为是致肿瘤过程的一个重要阶段。可以作为一种效应标志物,反映DNA受到有毒化学物质损伤的效应剂量^{〔3, 4〕}。赭曲霉毒素A在自然界分布广泛,毒性强,对人类和动植物影响大^〔5〕。本研究采用紫外以及荧光光谱法探讨OTA与小牛胸腺DNA和鲑鱼精DNA的相互作用,随着DNA浓度的增加,赭曲霉毒素A的紫外吸收峰和荧光光谱的位置与大小未发生改变,OTA和DNA未发生相互作用,说明DNA并不是OTA作用的靶器官。此结论与文献^〔6〕报道一致。DNA水溶液有特定的吸收光谱,任何化合物嵌入 DNA或与DNA分子形成加合物,均会引起DNA构象的改变,从而导致吸收光谱的改变。吸收光谱移动法能准确迅速地反映大分子物质在水溶液中的构象变化,因此可以用来研究化学物与大分子物质的结合反应^〔7〕。Mally等^〔8〕用14 C标记的 OTA喂养小鼠,通过高敏感光谱测定法并未检测到DNA加合物,本次研究的结论与其一致。