黄绿青霉素(citreoviridin,CIT)是黄绿青霉、黄暗青霉、瘿青霉、垫状青霉、毒青霉等青霉菌的次级毒性代谢物,在自然界中广泛存在,容易污染新收获的农作物,使其呈黄绿色霉变,食用后可发生急性中毒,是一种与人类生活密切相关的真菌毒素。现已证明,该毒素具有神经毒作用及致畸性,有研究认为,其可能是克山病的病因^〔1〕。该毒素在体外能抑制人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)活性及白色念球菌生长^〔2〕。但由于实验用黄绿青霉素价格昂贵,不利于进行深入研究工作,而实验室培养黄绿青霉菌,制备其毒素可受多种条件影响^〔3〕。本研究采用黄暗青霉菌,经培养、提取并纯化,合成黄绿青霉素,并观察其对大鼠心肌组织结构和功能的影响。结果报告如下。

(1)黄暗青霉菌(Penicillium citreonigrum Dierckx,PCV;中科院微生物研究所);黄绿青霉素(CIT)标准品(美国 SIGMA公司);(2)实验动物:健康雌性W istar大鼠20只(军事医学科学院实验动物中心),体重80~120 g,4周龄,观察和检疫1周后进入实验。(3)仪器与试剂:Olympus光学显微镜(日本奥林巴斯有限公司);超速低温离心机(美国贝克曼库尔特实验室);全自动生化分析仪(日本日立公司);spc- 10Avp液相色谱仪、Uv-V IS检测器(日本岛津公司);数据采集和处理色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);凯氏振荡器(青岛康信环保设备有限公司);净化工作台(苏州仁川洁净科技有限公司);恒温培养箱(日本三洋公司);手提式压力蒸汽消毒器(江阴滨江医疗设备厂);硅胶G (上海五四试剂厂);琼脂粉(上海晶天生物科技有限公司);乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、丙酮、甲醇、甲醛、戊二醛,均为国产分析纯。

(1)察氏(Czapek-Dox)培养基制备:准确称取NaNO₃ 3g,K2HPO₃ 1 g,KCl0.5 g,MgSO₄ 0.5 g,FeSO₄ 0.01 g,蔗糖30 g,琼脂20 g,充分溶于1 L水中,高压灭菌,倒入已灭菌培养皿中备用。(2)黄暗青霉菌培养及毒素提取:将产毒黄暗青霉菌接种在察式培养基上,25 ℃培养14 d,可观察到浅黄、黄白或灰绿色菌落,基底呈现黄色及表面有渗出液。将玉米浸泡后高压灭菌,加入30%无菌水后,接种含有黄暗青霉菌孢子的琼脂,于25 ℃培养3~5 d,肉眼观察其长出白色或绿色菌株,再于15℃培养14~21 d,玉米呈黄绿色变。黄变的黄暗青霉菌培养物60~70 ℃干燥,磨粉,无水乙醇萃取。将萃取液于旋转蒸发器上60~70℃减压浓缩,得棕色油状乙醇提取物。(3)黄绿青霉素纯化:将乙醇提取物溶解于热苯中,4 ℃放置数天,滤纸过滤,弃去不溶于苯的棕色物,逐滴加入正己烷于黄色苯溶液中,生成黄色沉淀,即乙醇原毒素。将乙醇原毒素用硅胶柱预处理。流出液为正己烷+丙酮(1:1);将黄色流出液浓缩蒸干,将其溶于甲醇溶液中,可见黄绿青霉素的黄色粉末生成。

将已蒸干的乙醇提取物及最后生成的黄绿青霉素,参照文献^〔4〕方法,采用高效液相色谱法检测黄绿青霉素含量,计算公式:C=(A/A´)×(I´/I)× S × (V/W),其中C为黄绿青霉素质量分数(ng/g),A为样品峰面积总计,A´为标准品平均峰面积总计,I´为标准品容积 (μL),I为样品容积(μL),S为黄绿青霉素标准品浓度(mg/ L),V为样品终容积(μL),W为样品质量(g)。

实验动物随机分为2组,每组10只。其中正常对照组饲以普通饲料;实验组每日喂饲15 mg/kg CIT,CIT含量随大鼠体重增加而增加。饲养温度为18~24 ℃,湿度40%~60%,12 h白昼,12 h黑暗。8周后,股动脉取血,分离血清;同时剪取心肌组织,部分心肌组织分别用10%甲醛和4.5%戊二醛固定。

心肌组织甲醛固定,常规石蜡包埋,苏木素(伊红染色,光学显微镜观察心肌组织病理学改变;电子显微镜观察心肌细胞超微结构的改变;采用全自动生化仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-M B)含量;采用化学发光法检测血清中肌钙蛋白T含量。

采用SPSS 11.0软件进行统计分析,各项酶学指标比较采用方差分析,血清肌钙蛋白T含量比较采用秩和检验。

图 1

图 1 黄绿青霉素标准色谱图

图 2

图 2 黄暗青霉菌乙醇提取物色谱图

图 3

图 3 合成的黄绿青霉素色谱图

样品进样量20 μL,标准物为50 μg/L。黄绿青霉素标准品呈双峰图谱,保留时间为8.5~10.5min (图 1);黄暗青霉菌乙醇提取物杂峰较多,表明该提取物中除黄绿青霉素外还含有大量其他物质(图 2);合成的黄绿青霉素杂峰明显减少,所含成分较单一,杂质较少,经检测,黄绿青霉素为196.5mg/kg (图 3)。

图 4

图 4 黄绿青霉素作用后大鼠心肌细胞变化

图 5

注: 核固缩呈凋亡状态, 核周大量肌丝溶解, 结构明显紊乱、增粗, 线粒体减少。 图 5 实验组心肌细胞电子显微镜图

光学显微镜下可见,实验组大鼠心室肌均出现明显病变,病变呈灶状或条索状分布,涉及范围较大,有大量淋巴细胞和单核细胞浸润,间质水肿(图 4A,图 4B),心肌细胞呈颗粒变性,肌浆凝聚,肌原纤维凝集、崩解,部分心肌细胞空泡变性(图 4C)。电子显微镜下可见,实验组心肌细胞核固缩呈凋亡状态,核周大量肌丝溶解,肌丝结构明显紊乱、增粗,肌丝间出现大量低电子密度区,线粒体数量减少。

表 1

表 1 黄绿青霉素对大鼠血清酶影响(U/L,x ± s)

表 1 黄绿青霉素对大鼠血清酶影响(U/L,x ± s)

实验组谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)4项均明显高于正常对照组(P < 0.01),2组之间谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的差异无统计学意义(P > 0.05)。表明黄绿青霉素作用后,部分心肌酶活性明显降低,功能下降。同时,正常组所有大鼠血清肌钙蛋白T含量均低于0.01 ng/mL,实验组则有半数大鼠血清肌钙蛋白T含量在0.45 ng/mL以上,高出正常对照组40~50倍,差异有统计学意义(P < 0.01)。

研究表明,不同温度、pH值以及不同培养时间对黄绿青霉菌产毒量均有较大影响^〔5〕。本实验所合成的黄绿青霉素所含成分较单一,杂质较少,产出量为196.5 mg/kg,与文献报道结果相近^{〔5, 6〕},表明本实验的培养温度湿度、时间,pH值以及提取方法、溶剂及检测方法的选择比较合适,纯化效果较好。大鼠实验结果表明,所合成的黄绿青霉素可引起心肌细胞结构和功能的明显变化,导致大鼠心肌发生变性和坏死,呈灶状散在,涉及面较大,有炎性细胞浸润,心肌细胞呈空泡样变,间质水肿,横纹消失。电镜下心肌细胞核固缩呈凋亡状态,核周肌丝溶解,结构紊乱,线粒体数量减少,与有关研究结果一致^〔7〕,同时还明显抑制大鼠血清中多种酶的活性。

本实验成功制备了黄绿青霉素,并可引起大鼠心肌改变和影响血清酶活性。今后应对提取、纯化效果的影响因素进行研究,以期获得最佳实验条件。