乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其疾病的发生涉及到多基因、多因素共同参与的复杂过程􀀁1􀀂。近年发现,固醇类激素受体家族成员包括雌激素受体(estrogen receptor,ESR)、维生素D受体(vitamin D receptor,VDR),在乳腺癌的病因学中起重要作用^{〔2, 3〕},这种作用不仅取决于受体蛋白功能和或表达水平上的改变,同时也可受基因水平变异的影响。本研究采用病例-对照模型,对来自浙江省温州地区的乳腺癌患者进行ESR和VDR基因多态性分析,以评价其与乳腺癌发病风险的关系。结果报告如下。

2008年4月-2010月4月收集来自温州医学院附属第一医院乳腺癌患者189例(病例组),所有患者乳腺癌的诊断均经组织病理学证实。选取同期在温州医学院附属第一医院进行健康体检的女性374人作为对照,对照人群均无相关临床症状,无肿瘤和遗传病史。所有患者及健康对照均为汉族,且无血缘关系。病例组年龄为28~78岁,平均为 50.7岁,对照组年龄为22~84岁,平均为44.9岁。2组年龄差异有统计学意义(P < 0.05)。

抽取乳腺肿瘤患者和健康人群的抗凝血3mL,用全血DNA提取试剂盒(上海飞捷生物公司)提取外周血基因组DNA,置于4℃保存,备用。

根据文献^{〔2, 3〕}设计特异性引物(上海捷瑞生物公司)。扩增ESRα基因rs2234693和 rs9340799的引物为:5´-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTC-CTATTCTCC -3´(正向)和5´-TCTTTCTCTGCCACCCTG-GCGTCGATTATCTGA-3´(反向);扩增VDR基因rs10735810位点的引物为:5´-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3´ (正向)和5´-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3´(反向)。PCR反应体系:10% EasyTaq缓冲液5 μL,25 mmol/L的 M gC1₂ 0.5 μL,各含25 mmo l/L的脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合液0.5 μL,10 μmol/L的引物P1和P2各0.4 μL,80~200 ng DNA模板,5 U/μL的EasyTaq DNA聚合酶0.25 μL (北京全式金生物公司),加水至50 μL。10μL PCR产物分别用 PvuII、Xba I和FokI内切酶(加拿大Fermentas公司)进行消化,酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。随机筛选部分样本送上海基康测序公司测序,进行突变验证。

对研究人群的3个位点基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验,应用SPSS 13.0软件分析基因型、等位基因在病例对照中的分布差异,包括χ²检验、Logistic回归分析等。应用SHE sis平台^〔4〕评价ESRα基因单体型分布差异,以 P < 0.05为统计学差异。

图 1

注: A图中1, 5, 10 为GG 基因型; 2, 3, 7 为AG 基因型; 4, 6, 8, 9为AA 基因型; B图中1, 2, 6 - 9 为TT 基因型; 3 - 5 为CT 基因型; 10为CC 基因型; C图中1, 7, 9 为CC 基因型; 2, 6 为CT 基因型; 3- 5, 8为TT 基因型; M 为Marker。 图 1 PCR-RFLP 分析ESR-和VDR 基因多态性的酶切电泳结果

ESRα基因rs2234693位点存在3种基因型,分别为CC基因型(1372 bp),CT基因型(1372,936,436 bp)和TT基因型 (936,436 bp);rs9340799位点存在GG基因型(1372 bp),AG基因型(1372,982,390 bp)和AA基因型(982,390 bp);VDR基因rs10735810位点存在CC基因型(265 bp),CT基因型 (265,196,69 bp)和TT基因型(196,69 bp)。

表 1

表 1 不同组别ESRα和VDR 基因型和等位基因分布情况

表 1 不同组别ESRα和VDR 基因型和等位基因分布情况

对病例组和对照组ESR􀀁基因rs2234693和rs9340799位点、VDR基因rs10735810位点的基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验,2组资料检测得到基因型观察值与预期值差异均无统计学意义(P > 0.05)。ESRα基因rs2234693位点和VDR基因rs10735810位点在病例及对照组中均以CT杂合子基因型为主,而ESRα基因rs9340799位点则以纯合子基因型AA为主。由于本研究所选取病例对照年龄存在差异(P < 0.05),所以采用Logistic回归分析排除年龄干扰。研究发现,ESRα基因rs9340799位点的基因型和等位基因在病例对照中的分布差异均有统计学意义;基因型GG与AA比较,或等位基因G与A比较,均具有较低的发病风险,OR值分别为 0.600(95% CI=0.397~0.906)和0.580(95% CI=0.413~ 0.815)。

表 2

表 2 不同组别ESRα基因单体型和复合基因型分布情况

表 2不同组别ESRα基因单体型和复合基因型分布情况

SHE sis软件分析显示ESRα基因rs2234693和rs9340799存在较强连锁不平衡现象(D=0.884,r²=0.357)。本研究人群中,ESRα基因以单体型TA占多数,而复合基因型则以TTAA为主,单体型CG在对照组人群中的分布(20.6%)明显高于病例组(13.7%),复合基因型CCGG在对照组人群中的分布 (5.61%)明显高于病例组(1.59%),提示携带有该单体型或该复合基因型的个体均具有较低的患乳腺癌风险。

本研究结果表明,rs2234693位点与乳腺癌虽未存在直接相关,但rs9340799位点如果等位基因为G,则发生乳腺癌风险仅为等位基因A的0.6倍,与Sh in等^〔5〕和陆旭等^〔6〕的研究相符。由于2位点均位于内含子1内,两者仅相距50bp,单体型或复合基因型表现形式更为重要。本研究发现携带有单体型CG或者复合基因型CCGG的个体均具有较低的患乳腺癌风险,其OR值分别为0.614和0.271。这2种结果均证实 rs2234693位点等位基因G为乳腺癌发病低危险因素。而该等位基因如何发挥作用尚不清楚,因该区域含有增强子、启动子等重要调节序列,推测在其中发生的点突变将有可能影响到ESR的表达和功能,从而影响到体内雌激素的最终生物学效应^〔7〕。

rs10735810(FokⅠ)位点位于VDR基因5'端的外显子2上,存在着碱基T和C的变异。当该位点为C等位基因时,编码时就会缺少一个起始区域,从而导致编码出来的VDR蛋白激活域位置缺少3个氨基酸。这种蛋白更易于激活其效应基因-VDRE基因从而发挥生理学作用,这种作用包括调节细胞增殖和分裂^〔8〕。Sino tte等^〔9〕的研究指出,与纯合子基因型 CC相比,TT具有更高的乳腺癌发病风险。本研究未发现 rs10735810位点的多态性与乳腺癌发病有直接的相关性,与多数报道的研究结果一致^〔10〕。本研究认为,一方面可能 rs10735810变异本身并非是乳腺癌发病的独立因素,另一方面,不同地域不同人群特殊的遗传背景也可能是导致结论不一致的原因之一。

综上所述,ESRα基因rs9340799位点单核苷酸多态性与乳腺肿瘤发生密切相关,虽然另一位点rs2234693与乳腺癌发病并无直接联系,但它通过连锁不平衡作用,与rs9340799位点形成单体型CG或复合基因型CCGG后,则具有较低的乳腺癌发病风险。然而本研究还存在一些不足,如还缺乏患者的绝经状态、ESR表达情况,样本和分析的位点数量不足,未对多个人群进行横向比较研究等,应进一步研究以得到更准确的结论。