研究表明,丙型肝炎病毒(HCV)的感染可以导致慢性肝 炎、肝硬化甚至肝癌的发生^〔1〕。HCV核心蛋白(Core,简称 C)的氨基酸序列十分保守,是一个具有多种生物学功能的病 毒蛋白,能够抑制细胞凋亡的启动,如激活c-myc启动子活 性,这种作用与HCV持续感染及肿瘤发生密切相关^〔2〕。近年来在感染HCV的患者血清中发现了HCVF蛋白,是由 HCVC基因编码的另一个产物,它是由C基因密码子核苷酸 移位后产生。有报道表明,在HCV肝癌患者血液中,F蛋白 的数量、F抗体的阳性率以及基因序列的突变率均高于非肝 癌HCV感染者人群,提示F蛋白可能与肝癌的发生发展有 关^〔3〕。为了观察F蛋白参与肝癌发生的可能性,探讨F蛋白对原癌基因的作用机制,本研究以基因重组获得的c-myc启 动子基因插入萤光素酶报告基因载体pGL 3-basic中,构建 pGL 3-cmyc-启动子区重组子,以人肝癌细胞系HepG 2细胞为靶细胞,应用瞬时共转染pGL 3-cm yc与HCV-F/C真核表 达质粒、萤光素酶活性测定的方法,分析HCV-F对c-myc启 动子萤光素酶报告重组体活性的影响。结果报告如下。

EDAS 290型数码凝胶成像分析系统(美国East-man Kodak公司);CO₂细胞培养箱(美国Forma Scientific公 司);PTC-150型PCR扩增仪(美国M J Research公司);电泳 槽与电泳仪(美国Bio-Rad公司)。人肝肿瘤细胞株HepG2 细胞(美国菌种保藏中心,ATCC)。达尔伯克改良伊格尔培 养基(DMEM培养基)(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。pGL 3-Basic质粒(美国 Promega公司);脂质体Lipofec tamine 2000(美国Invitrogen公司);萤光素酶和β-半乳糖苷酶分析系统(美国Promega公司);TaqDNA聚合酶及缓冲系统、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 混合物、DNA Marker (大连TaKaRa公司)。

HepG 2细胞培养于含10%胎牛血清的 DMEM培养液中。在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱 中培养,每2~3 d用0.25%胰酶消化传代,生长至85%融合 时消化传代细胞。

以HCV全基 因质粒pUC 119-full为模板,应用PCR方法扩增HCV-C基因序列,以HCV 1 b型C基因序列设计引物,扩增其在42位密 码子+1框移位及144位密码子终止,即HCV-F基因。引物序列如下:(1) HCV-F:F 1 5´-GCGCAACTGTTGG-GAAGGGCGATCGGTGCGG-3´,F 2 5´-CGCGCGCACACCCAAC-CTGGGCCCCTGCGCGGC-3´,F 3 5´-GGGGCCCAGGTTGGGT-GTGCGCGCGACTAG-3´,F 4 5´-ACG GAATTC TC-CTAGGGGGGCGCCGACGAGC-3´; (2) H CV-C:C 1 5´-ACG GGATCC ATGAGCACGAATCCTAAACC-3´,C 2 5´-ATA GAAT-TC GGAAGCTGGGATGGTCAAAC-3´。将HCV-C与HCV-F的 PCR扩增产物,双酶切后克隆到pcDNA 3.0质粒中,经上海英俊生物技术有限公司测序鉴定,得到pcDNA 3-C与pcDNA 3-F的真核表达质粒。

根据Wierstra^〔4〕的方法设计引物,扩增含有c-myc启动子P 1与P 2 区序列,将得到的c-my c基因启动子片段,克隆到pGL 3-Basic 质粒,得到含有c-myc基因启动子的pGL 3-cmyc萤光素酶报 告质粒。

将质粒用Lipofectamine 2000瞬时转染HepG 2细胞。将 HepG 2细胞接种于6孔板,4×10⁵/孔,待80%~90%细胞融 合后,分别用pcDNA 3-C、pcDNA 3-F真核表达质粒与pGL 3-cmyc报告基因质粒共转染HepG 2细胞。将质粒DNA (pcD-NA 3-C和pcDNA 3-F各2 μg,与pGL 3-cmyc 1.5 μg)与250 μL无血清、无抗生素的DMEM培养基混合,再将12 μL L ipo-fectamine 2000与250 μL相同的DMEM培养基混合;之后将上述二者混合,室温放置20 min后,直接将复合物加入到细 胞培养孔中,摇动培养板,轻轻混匀,24 h后收集细胞,荧光 素酶活性用GloMax发光检测仪进行检测,以发光值表示。

每次实验的重组质粒pGL 3-cmyc为1.5 μg,pcDNA 3-C和pcDNA 3-F各设5个剂量,分别为2,4,6,8 和10 μg,Lipofectamine 2000转染HepG 2细胞方法同1.2.4,24 h后收集细胞,荧光素酶活性用GloMax发光检测仪进行检测,以发光值表示。

采用萤光素酶和β-半乳糖苷酶分析 系统,萤光素酶活性用GloMax发光检测仪进行检测,以发光 值表示;β-半乳糖苷酶活性用酶标仪检测,以波长420 nm的吸光度值表示。相对萤光素酶活性=萤光素酶发光值-本底 发光值/β-半乳糖苷酶吸光度值。相对荧光素酶活性即代表 c-myc启动子活性。

应用SPSS 12.0软件进行统计分析,采用t检验。

图 1

注:与阴性对比照比较, * P < 0.05。 图 1 HCV􀀁F与HCV􀀁C 对c􀀁myc启动子转录水平的激活作用

在 HepG2细胞中共转染c-myc启动子萤光素酶报告质粒和HCV F或C基因的真核表达质粒,结果显示,HCVC基因可明显促 进c-myc基因启动子的转录活性,其对c-myc的转录活性约为对照组的7倍。HCV F基因对c-myc基因启动子转录活性相对HCV C基因的作用稍弱,约为对照组的3倍,差异具有 统计学意义(P < 0.05)。

图 2

图 2 pcDNA 3-C 和pcDNA 3-F对c-my c启动子 转录活化作用的量效关系

在HepG 2细胞中共转染c-myc启动子萤光素酶报告质粒 和不同剂量的HCV F或C基因的真核表达质粒,结果显示,pcDNA 3-C与pcDNA 3-F的剂量由2 μg增加至10 μg时,HCVC基因对c-myc启动子的转录激活作用呈剂量依赖性,HCVF基因对c-myc启动子的转录激活作用的剂量依赖作用 不明显,均约为对照组的3倍。

2001年,Walewski等^〔5〕对8株不同基因型的HCVC蛋白的序列分析结果表明,第11位苏氨酸密码子均为ACC,而理论上该苏氨酸为相同密码子的概率仅为1/1684,因此推断C区基因内含有未知的重叠基因或者隐含着未知基因。同年,实验证实了HCV自然感染过程中确实可产生由C基因编码 一种新型结构蛋白,命名为F蛋白^〔6〕。研究表明^〔3〕,在H CV 慢性患者和HCV所致肝细胞癌(HCC)患者体内均可检出F抗体,而且在H CV所致的肝癌患者肿瘤组织内可检出F蛋白,提示F蛋白和HCV慢性化和肝癌形成有关。

HCVC蛋白作为一种反式激活蛋白,不仅可以激活人c-myc基因,下调p 21启动子及p 53活性,也能够抑制T细胞 的增殖和IFN-γ的产生,阻碍机体对HCV感染肝细胞的清除,促使HCV感染慢性化及HCC的发生^〔6〕。HCVF蛋白与C蛋白均由HCVC基因编码产生,F与C蛋白同时在体内表达,以往认为C蛋白的某些功能可能与F蛋白有关,因此值得重新探讨F蛋白在HCV生活周期中的作用。本研究将 HCV F或C基因的真核表达质粒与c-myc萤光素酶报告质粒 共转染HepG 2细胞,观察HCV-F与HCV-C对c-myc基因启动子的转录调控作用的异同。实验结果表明,HCV-F对c-myc启动子转录活性具有激活作用,在剂量为2 μg时,启动子的转录活性约为对照组的3倍,c-myc启动子对HCV-F的 剂量依赖激活作用不明显。刘重阳等^〔7〕用半定量PCR检测 表达HCVC蛋白细胞的c-myc表达量,并分析细胞的凋亡率,发现C蛋白能够使c-myc的转录水平增加,且细胞较耐受 凋亡。在本实验中,C蛋白的表达亦可激活c-myc基因,与既往报道一致。

由于F蛋白是新近发现的HCV的一种结构蛋白,它与肿 瘤的关系以及与肿瘤相关的基因调控的研究还处于起步阶段。本研究证实了F蛋白与c-myc启动子活性调控在肿瘤发 生机制中具有相关性,为F蛋白参与肝癌发生与发展的基因 调控研究提供了新的思路。