单增李斯特菌是一种能够引起人畜共患的食源性致病菌，属李斯特菌属，在自然界中分布广泛^〔1〕。食用了被单增李斯特污染的食物后可以引起李氏杆菌病，使人和动物患脑膜炎、败血症、流产等，死亡率可达20%～30%^〔2〕。为完成国家食源性疾病监测网的监测任务，掌握吉林省食品中单核细胞增生李斯特菌的污染状况，于2009年7-8月对动物性水产品、蔬菜、生鲜肉类、熟肉、中式凉拌菜和沙拉五大类高危食品共计180份样品进行了单核细胞增生李斯特菌检测，现将结果报告如下。

(1)标准菌株:单核细胞增生李斯特菌CMCC54004(中国疾病预防控制中心):伊氏李斯特菌ATCC19119(辽宁省出入境检验检疫局);英诺克李斯特菌ATCC33090(本实验室保存);马红球菌(北京陆桥生物技术有限责任公司)。(2)试剂与仪器:李斯特菌增菌肉汤基础(LB1、LB2)动力培养基(SIM)、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)、丫啶黄、奈啶酮酸、木糖和鼠李糖(北京陆桥生物技术有限责任公司);李斯特菌科玛嘉显色培养基(郑州博赛生物制品有限公司):APIlistrial0300生化试剂盒(法国梅里埃生物制品有限公司);DNA提取试剂盒、溶菌酶、Taq酶、琼脂糖(美国Promega公司);核苷酸混合物(dNTP)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝(大连宝生物工程有限公司)。TGRADIENT型PCR扩增仪(德国BIOMETRA公司);GelDoc2001型凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司);DYY-III型稳压稳流电泳仪、DYY-III31CA型水平琼脂糖电泳槽(北京六一仪器厂);752型紫外光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂);2，20，100，1000μL微量加样器(法国GILSON公司)。(3)样品来源:吉林省3个市区(长春、吉林、四平)均匀随机采样，分别采自农贸市场和食品超市各50%。动物性水产品40份、蔬菜20份、中式凉拌菜和沙拉50份、生鲜肉类40份(包括生猪肉、生鸡肉、生牛肉、生羊肉)，熟肉30份，共计五大类180份样品。(4)单核细胞增生李斯特菌分离和鉴定:按GB/T478930-2008《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》方法^〔3〕进行样品前处理、增菌液增菌、二次增菌、分离、可疑菌落初筛、染色镜检、动力试验、溶血试验、协同溶血试验(cAMP)。李氏溶血素O(Hly)毒力基因检测:①引物:针对单核细胞增生李斯特菌溶血素基因设计引物，委托上海生物工程技术服务有限公司合成。单核细胞增生李斯特氏菌特异性引物序列为:上游(F):5'-GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC-3'，下游(R):5'-CTTG'CAACTGCTCTTTAGTAACAGC-3'。②PCR检测:根据试剂盒说明书取1mL被检样李斯特氏菌增菌肉汤用于DNA的提取和模板DNA的制备;PCR反应体系为:20μL，双蒸水12.8μL;10×buffer2.0μL，Mg2+(25mol/L)2.0μL，4×dNTP(10mmol/mL)1.6μL，Primer(30pmol/μL)各0.25μL，TaqE(2.5U/μL)0.1μL，DNA(20～30ng/μL)1.0μL;扩增条件为:预变性94℃5min，变性95℃60s，退火63℃60s，延伸72℃60s，30个循环，再延伸72℃8min，20℃终止反应。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶，100V电压电泳，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像分析仪中观察扩增结果，扩增片段长度为706bp。

(1)单核细胞增生李斯特菌检测结果:5类食品中单核细胞增生李斯特菌总阳性率为11.1%(20/180)。污染最严重的是动物性水产品，阳性率为32.5%(13/40)，其次是蔬菜，为25.0%(5/20)，生鲜肉阳性率为5.0%(2/40);熟肉、中式凉拌菜和沙拉均未检出单核细胞增生李斯特菌。(2)单核细胞增生李斯特菌生化鉴定结果:检出的20株单核细胞增生李斯特菌生化特性均为G+短杆菌、溶血试验(+)、术糖(-)、鼠李糖(+)、cAMP(协同溶血试验)试验:靠近金黄色葡萄球菌侧溶血增强;APIisteria结果为:酶底物，(DIM)(-)、七叶苷(ESC)(+)、α-甘露糖苷酶(α-MAN)(+)、D-阿拉伯糖醇(DARL)(+)、D木糖(XYL)(-)、鼠李糖(RHA)(+)、D-葡萄糖苷(MDG)(+)、核糖(RIB)(-)、葡萄糖-l-磷酸盐(GIP)(-)、塔格糖(TAG)(-)。根据检测结果，按APIlisteria编码本查得本次检测的菌株编码为:6510(3)单核细胞增生李斯特菌溶血素基因的检测结果。应用PCR方法对从食品中分离到的20株单核细胞增生李斯特菌进行李氏溶血素O测定，结果在706bp处均检出单核细胞增生李斯特菌的溶血素O基因片段。

本次监测结果表明，吉林省的高危食品中单核细胞增生李斯特菌的污染状况比较严重，特别是动物性水产品、蔬菜、生鲜肉类，其污染率分别为32.5%，25.0%、5.0%。说明吉林省存在李斯特菌食物中毒的潜在危险，提示在加大高危食品监测和监督力度的同时，要提高中毒标本中单核细胞增生李斯特菌的检测能力和水平。由于该菌在4℃冰箱保存的食物中也可生长繁殖，故其危害性进一步增大。其致病因子为李氏溶血素O(Hly)，随着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多，食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越大。单核细胞增生李斯特氏菌在706bp处有目的片段扩增，其余菌种未见扩增，说明该检测方法具有较好的特异性。用PCR方法检测食品中的单增李斯特氏菌，操作简便、快速、检测成本低。且有较高的灵敏性和特异性，适宜于食品中单增李斯特氏菌的快速筛选、确认和鉴定。