间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能^{〔1, 2〕}。目前研究最多的是骨髓MSCs，但其必须通过有创伤性的途径获得，而且随着时间的延长，干细胞数量明显减少^〔3〕。因此，寻找更易获得、含量丰富且易于培养的MSCs来源，对MSCs的实验研究具有重要意义。本研究从人羊膜组织中分离纯化MSCs，为人羊膜间充质干细胞(AMSCs)的进一步研究及临床应用提供基础。

胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)、DMEM/F12液体培养基、IMDM培养基、胰蛋白酶干粉(美国Hyclone公司);乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA，山东瑞阳制药厂);DMEM/F12干粉(美国Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司);牛血清白蛋白(BSA，美国Amresco公司);鼠抗人单克隆抗体(HLA-DR、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105、CD11a、CD11b、Pan-CK)(美国BioLegend公司);羊抗鼠二抗(美国SouthernBiotech公司);流式细胞仪(美国BD公司);地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、维生素C、β磷酸甘油(美国Sigma公司)。

无菌条件下从健康足月顺产胎儿的胎盘胎儿面钝性分离羊膜约10cm×10cm，用D-hank's缓冲液充分冲洗，然后将羊膜剪碎，约1mm×1mm×1mm，按照1cm的间距接种于25cm²的一次性塑料无菌培养瓶中，并于培养瓶中加入适量的完全DF12培养液。

培养基采用1∶1的DMEM/F12加体积分数为10%的FBS，将已经接种好羊膜的无菌培养瓶置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养48～72h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据羊膜周围细胞生长情况，决定换液时间，待细胞达到80%～90%融合时，用0.125%胰酶消化，然后按1∶3或1∶2的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每3d全量换液，直至贴壁细胞达到80%～90%融合时，再重复上述操作。

取生长状况良好细胞绘制生长曲线，每次计数3 瓶细胞并取平均值。

将培养3～5代的细胞用0.125%的胰蛋白酶消化、离心后，用含5%BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次，弃上清，将细胞悬浮于5%BSA的PBS中。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体:CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD45、CD11a、CD11b、HLA-DR和Pan-CK，再加羊抗鼠二抗，置4℃孵育30min。采用间接免疫荧光法。应用流式细胞仪进行测定，采用WinMDI29软件分析结果。

取AMSCs按3×10⁴/mL密度接种于25cm²一次性无菌培养瓶中，待细胞达到60%融合后，加入成脂细胞诱导分化液(10^-6mol/L地塞米松+0.5mol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤+0.1mol/L维生素C+10%FBS的IMDM)作为实验组;对照组不加诱导剂，并用油红O染色进行检测。

取AMSCs按2×10⁴/mL密度接种于25cm²一次性无菌培养瓶中，待细胞达到50%融合后，加入成骨细胞诱导分化液(10^-7mol/L地塞米松+10mol/Lβ磷酸甘油+0.05mol/L维生素C+10%FBS的IMDM培养基)作为实验组;对照组不加诱导剂，并用Vonkossa染色进行检测。

用含10%FBS的DMEM/F12培养基，在一次性无菌塑料培养瓶中培养细胞，约1周左右组织块周围开始有细胞爬出。此后，细胞数量逐渐增多，显微镜下观察，细胞多呈梭形和多角形，少数呈星形和圆形。通过全量换液，逐渐去除未贴壁的羊膜，10d后细胞形态逐渐均匀，出现2种细胞克隆:(1)成纤维细胞样克隆，细胞呈长梭形，培养至14～16d细胞达80%～90%融合，呈放射状或漩涡状分布;(2)上皮细胞样克隆，呈多角形的上皮细胞形态，几个、几十个细胞的克隆。随着培养的进行，成纤维样细胞优势生长，传代后细胞24h内完全贴壁，上皮细胞样细胞少见，5d左右达到80%～90%融合，长满瓶底，传至3代，细胞形态均匀，均呈长梭形。培养至6代时，可见细胞形态稳定，并保持良好的增殖能力。

取AMSCs按照4.23×10⁴/mL的浓度接种于12孔板中，每天于特定的时间内分别取3个孔中的细胞进行计数，取其平均值，绘制生长曲线。结果显示，AMSCs符合MSCs的生长特点，对数生长期倍增时间约为30h。

经流式细胞仪检测，AMSCs稳定高表达CD44、CD29、CD105，多次检测阳性率分别为(98.70±0.25)%，(97.69±0.18)%，(99.20±0.05)%，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD11a、CD11b、Pan-CK多次检测均为阴性。

进行成脂细胞诱导时，细胞的接种密度分别为2×10⁴，3×10⁴，3.5×10⁴cell/mL，同样用含10%胎牛血清的DF12培养基进行细胞培养，待细胞分别达到50%，60%，70%融合后，换用脂肪细胞诱导液。结果发现在细胞达到60%融合时，进行成脂细胞诱导效果最好。诱导分化3～5d后发现细胞形态逐渐向类圆形转变，体积变大，少量细胞的细胞质内出现圆形透亮小滴，继续诱导，1周后可以看见大部分细胞胞浆中出现大量脂滴，油红O染色大部分细胞质内可见大小不一的脂肪滴呈橘红色，浅蓝色胞核被挤于细胞一侧或中央;而对照组细胞胞浆中无脂肪滴出现，油红O染色阴性。

进行成骨细胞诱导时，细胞的接种密度分别为1×10⁴，2×10⁴，3×10⁴cell/mL，并用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行细胞培养，待细胞分别达到40%，50%，60%融合后，换用成骨细胞诱导液培养。结果显示，在细胞达到50%融合时，进行成骨细胞诱导效果最好。2周后出现少量钙盐沉积。继续培养1周，细胞周围出现大量钙盐沉积，而对照组细胞无钙盐沉积。VonKossa染色显示有黑色的钙化基质沉淀，成骨细胞因包埋在钙化基质中而见不到清晰的细胞轮廓;而对照组无上述现象出现。

AMSCs是从新鲜羊膜组织中分离培养出的MSCs，与骨髓MSCs具有相似的自我更新能力和多向分化潜能，取材方便，来源广泛，不受伦理学限制，是细胞移植和组织工程种子细胞的理想材料。本研究采用组织块培养法得到以间质细胞为主的细胞群体，然后通过全量换液，逐渐去除未贴壁细胞。传代过程中，根据细胞黏附能力的不同，通过调整胰蛋白酶的消化时间，保证AMSCs在短时间内与培养皿底分离，而其他细胞如成纤维细胞，仍然贴附于培养皿底，从而使羊膜MSCs逐步纯化，逐渐去除贴壁的其他细胞污染。通过流式细胞术证实AMSCs具有高度的同源性，并在体外能够向脂肪和成骨细胞诱导分化，从而证实了AMSCs与其他组织来源的MSCs具有相似的生物学特性^{〔4, 5, 6〕}。目前对MSCs的研究尚处于探索阶段，还存在很多问题:(1)MSCs的真正起源，体外培养的MSCs均为各种细胞的混杂，如何能够获得纯的MSCs有待研究;(2)MSCs的增殖、分化的控制需要合适的条件，如何使既控制增殖，避免发生肿瘤，又能在适当的时候启动所需要的途径进行分化;(3)MSCs间相互作用，MSCs与造血干细胞间相互作用、MSCs与不同成熟阶段的细胞相互作用直接对其生长、分化产生的影响等。上述问题尚需进一步研究。