中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (11): 1399-1400   PDF    
引用本文
付萍, 吴建伟, 国果. 家蝇幼虫血淋巴不同Tricine-SDS-PAGE分析方法比较[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(11): 1399-1400.
FU Ping, WU Jian-wei, GUO Guo. Determination of hemolymph of Musca domestica( housefly) larvae with Tricine-SDS-PAGE[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(11): 1399-1400.
家蝇幼虫血淋巴不同Tricine-SDS-PAGE分析方法比较
付萍, 吴建伟, 国果     
贵阳医学院寄生虫学教研室, 贵阳550004
收稿日期: 2010-04-16.
基金项目: 国家自然科学基因(30960343);贵州省教育厅基金(F2008-6)
作者简介: 付萍(1980-),女,讲师,博士在读,研究方向:医学昆虫免疫与病理生理学。
通讯作者: 吴建伟
摘要: 目的 用3种不同的三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)方法分析家蝇三龄幼虫血淋巴。方法 分别用不含尿素也不含甘油的分离胶组成的普通Tricine-SDS-PAGE方法,分离胶中有尿素组分的三层胶方法,分离胶中有甘油组分的三层胶方法分析家蝇三龄幼虫血淋巴。结果 家蝇幼虫血淋巴中含有丰富的小分子多肽,用不含尿素也不含甘油的分离胶组成的普通Tricine-SDS-PAGE方法不能有效分离分子量在＜10.700 kDa的小分子蛋白或多肽;分离胶中有尿素组分的三层胶方法虽能清晰分离家蝇幼虫淋巴中＜16.949kDa的小分子蛋白或多肽,但对其分子量的测定可能不够准确;而分离胶中有甘油组分的三层胶方法既能很好分离＞14.4 kDa的蛋白,也能清晰分离＜8.159 kDa的小分子多肽,并能较准确的反映其分子量大小,用于分析家蝇幼虫血淋巴效果较好。结论 分析家蝇幼虫血淋巴应采用分离胶中有甘油组分的三层胶的电泳方法。
关键词: 家蝇幼虫     血淋巴     电泳     三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳    
Determination of hemolymph of Musca domestica( housefly) larvae with Tricine-SDS-PAGE
FU Ping, WU Jian-wei, GUO Guo     
Department of Parasitology, Guiyang Medical Colledge, Guiyang 550004, China
Abstract: Objective Three different methods of Tricine-sodium dodceyl sulfate polycarylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE)were used to analyze the hemolymph of Musca domestica(housefly)larvae.Methods The hemolymph of Musca domestica(housefly)larvae was analyzed with the separating gel without urea or glycerol in ordinary Tricine-SDS PAGE method,with the urea separating gel method,and the separating gel with glycerol method.Results The results showed that there were abundant low molecular peptides in the hemolymph of housefly larvae.The separating gel without urea or glycerol in ordinary Tricine-SDS PAGE method could not effectively separate the low molecular proteins and peptides with the molecular weight below 10.700 kDa.The result of analysis with the urea separating gel showed that it could effectively separate the hemolymph of housefly larvae,especially the low molecular peptides,but the determination of its molecular weight was not accurate.And the separating gel with glycerol achieved good results not only in separating the low molecular peptides but also in determining the molecular weight.Conclusion The method of the separating gel with glycerol could achieve satisfactory results in the determination of the hemolymph of housefly larvae.
Key words: housefly larvae     hemolymph,     electrophoresis     Tricine-SDS-PAGE    

家蝇自身不染病主要依赖其体内的由许多活性物质构成 的特殊免疫防御机制，其中，血淋巴中含有的丰富的抗菌肽、 抗真菌肽等多种活性多肽发挥着重要作用〔1,2,3,4〕。本研究选用 3 种三羟甲基甘氨酸- 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电 泳( Tricine-SDS-PAGE) 体系对家蝇3 龄幼虫血淋巴进行分析 比较。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试虫种

驯化家蝇(本实验室传代繁殖)，幼虫饲养于麦麸中，成蝇以奶粉、白糖及清水为饲料，奶粉和白糖混合，清水另置，避免污染。饲养条件:温度(25±1)℃，相对湿度(RH)50%～60%，光照黑暗各12h交替。取家蝇3龄幼虫为供试材料。

1.1.2 试剂与仪器

丙烯酰胺(美国Amresco公司)，甲叉双丙烯酰胺(美国Amresco公司)，过硫酸铵(AP)(美国Amresco公司)，Tris碱(美国Amresco公司)，三羟甲基氨基甘氨酸(Tricine)(美国Amresco公司)，四甲基乙二胺(TEMED)(美国Sigma公司)，十二烷基硫酸钠(SDS)(华美生物工程有限公司);蛋白质分子量标准品(上海生物化学研究所，分子量为14.4～97.4kDa)，多肽分子量标准品(美国Amersham公司，分子量为2.512～16.949kDa)，蛋白分析试剂盒(美国Pierce公司)。电泳仪(北京六一厂)，BG-verMINI迷你垂直电泳仪(北京Baygene公司)，μ-Quant酶标分光光度仪(美国BIO-TEK公司)。

1.2 方法 1.2.1 家蝇幼虫血淋巴的提取

取家蝇三龄幼虫，洗净后，分条剪去蝇蛆头部，收集血淋巴并用超纯水将其稀释10倍，沸水浴5min，12000r/min、4℃离心30min后，收集上清液并用蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度后备用。

1.2.2 电泳及染色方法

方法1凝胶配制及电泳条件参照文献〔5〕;方法2凝胶配制及电泳条件参照文献〔6〕;方法3凝胶配制及电泳条件参照文献〔7〕。

1.2.3 凝胶染色及脱色

电泳结束后，小心将凝胶取下，加入染色液(考马斯亮蓝R250:0.1g，50%乙醇:90.0mL，冰乙酸:10.0mL)振荡染色30min，再转至脱色液(无水乙醇、冰乙酸、水按4∶0.4∶5.6的体积比混合)中进行脱色，期间更换脱色液2次，直到背景清晰。

2 结果 2.1 家蝇幼虫血淋巴方法1 分析结果( 图 1)
注:M1:蛋白质分子量标准;M2:肽类分子量标准;1～6:家蝇幼虫血淋巴(上样量分别为60，50，40，30，20，10μg)。图 1 家蝇幼虫血淋巴方法1Tricine-SDS-PAGE 分析

从图一可以看出，方法1对分子量在＞20.1kDa的大分子蛋白的分离效果较好，而对分子量在＜10.700kDa的小分子蛋白或多肽的分离效果较差。蛋白质分子量标准的6个条带均显示清晰，但肽类分子量标准仅显示出4个条带，分子量较小的末2个条带未能显示;经剪头法所提取得到的家蝇幼虫血淋巴粗提液，在凝胶上的分离条带略显模糊，上样量对分离效果的影响不明显。另外，经反复试验发现，在电泳过程中，当各样品进入分离胶后，前沿带便出现扩散现象，且不断变宽，不利于观察电泳终点。

2.2 家蝇幼早淋巴方法2分析结果( 图 2)
注:M1:蛋白质分子量标准;M2:肽类分子量标准;1～6:家蝇幼虫血淋巴(上样量分别为60，50，40，30，20，10μg)。图 2 家蝇幼虫血淋巴方法2Tricine-SDS-PAGE 分析

图 2结果显示，蛋白质分子量标准的前4个条带显示清晰，但条带间的距离过近，而末2个条带稍显模糊;肽类分子量标准的6个条带均能清晰显示，效果较好;经剪头法所提取得到的家蝇幼虫血淋巴粗提液，上样量为20、10μg时分离效果较好;但值得注意的是，蛋白质分子量标准的最末1个条带(14.4kDa)与肽类分子量标准的第2个条带(14.404kDa)在理论上应该在一条直线上，而经反复试验的结果却有明显偏差。可见，方法2对家蝇幼虫血淋巴的分离效果较好，但对其分子量的测定可能不够准确。

2.3 家蝇幼虫血淋巴方法3分析结果(图 3)
注:M1:蛋白质分子量标准;M2:肽类分子量标准;1～6:家蝇幼虫血淋巴(上样量分别为60，50，40，30，20，10μg)。图 3 家蝇幼虫血淋巴方法3Tricine-SDS-PAGE 分析

图 3结果显示，蛋白质分子量标准和肽类分子量标准的6个条带均能清晰显示，分离效果较好;经反复试验，蛋白质分子量标准的最末1个条带(14.4kDa)与肽类分子量标准的第2个条带(14.404kDa)基本在一条直线上，在分析样品分子量时有了较标准的依据。经剪头法所提取得到的家蝇幼虫血淋巴粗提液，用方法3进行电泳分析后，可清楚发现，在66.2～97.4kDa间有蛋白条带，主要蛋白组分集中在6.210～20.1kDa。可见，方法3用于分析家蝇幼虫血淋巴粗提液时能取得满意的效果。

3 讨论

本实验采用3种Tricine-SDS-PAGE方法分析家蝇3龄幼虫的血淋巴，取得了不同的效果，且样品上样量为40或50μg(蛋白含量)时的分离效果较好。Tricine-SDS-PAGE是目前一种有效分离小分子蛋白、多肽的电泳方法〔8〕。在Tricine-SDSPAGE体系中，Tricine以阳离子形式存在可以作为拖尾离子，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带，对小分子多肽的分辨率明显提高〔6〕。本实验中的方法1不适于分析小分子多肽，其分离胶组成中无尿素也无甘油。方法2中的分离胶属于尿素胶，虽能很好的分离小分子多肽，但不能准确反映其分子量大小。方法3中的分离胶属于甘油胶，既能很好分离小分子多肽，也能较好反映其分子量大小，是分析小分子多肽较好的方法，为分析家蝇幼虫血淋巴的一种较好的选择。

参考文献
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