中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (11): 1395-1397   PDF    
引用本文
宣志强, 杨锦蓉, 路艳艳, 李雪芝, 黎君, 王菁. 二甲基甲酰胺对人肝细胞凋亡相关蛋白影响[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(11): 1395-1397.
XUAN Zhi-qiang, YANG Jin-rong, LU Yan-yan, et al. Effects of N, N-dimethylformamide on Caspase-3’s activation in human hepatocytes in vitro[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(11): 1395-1397.
二甲基甲酰胺对人肝细胞凋亡相关蛋白影响
宣志强1, 杨锦蓉1, 路艳艳2, 李雪芝3, 黎君3, 王菁3    
1. 浙江省疾病预防控制中心辐射与核安全防护所, 杭州310051;
2. 浙江省医学科学院卫生学研究所;
3. 浙江大学医学院环境医学研究所
收稿日期: 2010-02-10.
基金项目: 浙江省医药卫生科学研究基金项目(2005B019)
作者简介: 宣志强(1978-),男,浙江杭州人,主管医师,硕士,研究方向:环境与职业毒理学。
摘要: 目的 探讨不同剂量二甲基甲酰胺(DMF)在不同染毒时间下对人正常离体肝细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)激活的影响。方法 以0,6.25,25,100 mmol/L的DMF染毒正常成人肝细胞12 h,100 mmol/L的DMF染毒肝细胞0,3,6,12 h,应用蛋白印记法(Western法)观察Caspase-3激活的变化。结果 随着染毒剂量的增加,Caspase-3原酶形式(Procapase-3)表达水平呈下降趋势,但各染毒组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);100 mmol/L染毒组Caspase-3激活水平最高,灰度比值为0.55,各染毒组间比较差异有统计学意义(F=7.684,P＜0.01);随着染毒时间增加,Caspase-3激活水平逐渐增加,12 h染毒组灰度比值最高,达0.48,各组间比较,差异有统计学意义(F=9.351,P＜0.01)。结论 Caspase-3的激活参与了DMF致人肝细胞的凋亡过程,并呈现良好的时间-剂量效应关系。
关键词: 二甲基甲酰胺     肝细胞     凋亡相关蛋白    
Effects of N, N-dimethylformamide on Caspase-3’s activation in human hepatocytes in vitro
XUAN Zhi-qiang, YANG Jin-rong, LU Yan-yan, et al    
Department of Radiation Protection and Nuclear Safety, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, China
Abstract: Objective To discuss the effect of N,N-dimethylformamide(DMF)at different dose and exposure time on Caspase-3's activation in normal human liver cells in vitro.Methods The human hepatocytes were exposed to DMF at the concentrations of 6.25,25,100 mmol/L for 12 hours.Then the hepatocytes were exposed to DMF at the concentration of 100 mmol/L for 0,3,6 and 12 hours.The control group was treated with phosphate buffered saline.Western blotting was performed to observe the activation of Caspase-3 in human hepatocytes.Results With the increasing of DMF dose,the ratio of pro-Caspase-3's grey value showed a declined trendency on the whole but without statistical difference between different groups(F=1.363,P>0.05).Different dose of DMF could increase the activation of Caspase-3(F=7.684,P<0.01)with a tendency of increment with the increasing of dose.The average ratio of Caspase-3 subunits'grey value in 100 mmol/L group was the highest(0.55).With the increasing of exposure time,there was no statistical difference in pro-Caspase-3's grey value between different groups(F=0.490,P>0.05)with a declined trendency as the increasing of exposure.The ratio of Caspase-3 subunits'grey value significantly increased with the time of exposure(F=9.351,P<0.01)and the highest was 0.48 in the group of 12 hours'exposure.Conclusion Activation of Caspase-3 involves in the process of apoptosis induced by DMF in human hepatocytes and the activation level of Caspase-3 activation shows a good time-and dose-dependent relation with the exposure of DNF.
Key words: N,N-dimethylformamide     hepatocyte     apoptosis-associated protein    

二甲基甲酰胺( N，N-dimethylformamide，DMF) 是一种无 色透明，带有鱼腥味的液体，具有化学和热稳定性好、沸点高、 凝固点低、溶解能力强等特点，是一种工业应用较为广泛的有 机溶剂。在作业环境中DMF 主要经呼吸道、皮肤及消化道 吸收。DMF 侵入人体后，主要靶器官是肝脏，目前DMF 引起 肝脏损伤的具体机制尚不清楚。本研究采取体外培养肝细 胞，以不同浓度DMF 染毒、在不同时间观察DMF 对凋亡相 关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶- 3 ( Caspase-3) 激活的影 响，探讨DMF 致肝细胞毒性机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

RPMI1640培养基(美国GIBCO公司);胰酶(美国AMRESCO公司);小牛血清(杭州四季青公司);鼠抗人Caspase-3单克隆抗体、Westernblotting用化学发光剂鲁米诺(美国SantaCruz公司);鼠抗人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(上海康成生物技术有限公司);山羊抗鼠辣根过氧化物酶-IgG(HRP-IgG)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。低温高速离心机(德国Eppendorf公司);电泳及转膜装置、SmartspecTM核酸蛋白定量仪(美国Bio-Rad公司);制冰机(日本Sanyo公司)。

1. 2 细胞染毒

正常成人肝细胞(中科院上海生命科学研究院细胞库)，代号HL-7702。根据本实验室细胞毒性实验结果〔1〕，加入DMF使终浓度为0(对照组，加等体积磷酸盐缓冲液)，6.25，25，100mmol/L，继续培养12h，此外100mmol/L染毒组经0，3，6，12h不同染毒时间染毒，观察肝细胞Caspase-3激活变化，实验重复3次。

1.3 蛋白检测

染毒后细胞蛋白质裂解、超声破碎收集蛋白，考马斯亮蓝G-250法测蛋白浓度，加入等体积5倍十二烷基硫酸钠(SDS)电泳上样缓冲液，混匀后置入沸水中加热5min，即为可电泳蛋白样品。每孔加30μg蛋白样品电泳，采用5%积层胶电压50V，12%分离胶电压90V等电压电泳。利用电转移槽100V、1.5h恒压转膜，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上进行封闭和免疫反应，用化学发光法得到蛋白条带图片〔2〕。

1.4 统计分析

Western结果用Bio-Rad扫描仪扫描成图片，蛋白条带灰度使用Quantity One 4.6.2软件进行分析，采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett's T 3法。

2 结果 2.1 不同浓度DMF 染毒后Caspase-3 表达 2.1.1 GAPDH 及Caspase-3 扫描结果( 图 1)
注:上图为GAPDH条带，36kDa;下图上排为酶原，32kDa，下排依次为Caspase-3的17、11kDa亚基，从左至右依次为0，6.25，25，100mmol/LDMF组。图 1 不同浓度DMF 染毒12 h 后人肝细胞Caspase-3 变化

DMF不同染毒浓度组内参GAPDH表达条带粗细均匀一致，而Caspase-3的酶原形式(Procaspase-3)条带在100mmol/L组略微变细，并出现2条新条带，提示酶原被切割活化，至上而下分别为Caspase-3的17kDa、11kDa亚基条带。

2.1.2 Caspase-3 灰度比值( 表 1)
表 1 不同浓度DMF 染毒Caspase-3 灰度比值(±s，n= 9)

Procaspase-3灰度值比值为0.94～1.18，各染毒组之间比较差别无统计学意义(F=1.363，P＞0.05);Caspase-3亚基灰度值比值组间比较差异有统计学意义(F=7.684，P＜0.01)，随着染毒浓度增加，Caspase-3亚基灰度值比值逐渐增加。

2.2 DMF 染毒不同时间Caspase-3 激活

Procaspase-3灰度值比值为0.70～0.86，不同染毒时间比较差异无统计学意义(P＞0.05);染毒0，3，6，12h，Caspase-3亚基灰度比值分别为0.03，0.04，0.24和0.48，组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。与0h组比较，6、12h组Caspase-3亚基表达水平明显增高(P＜0.05)，随着染毒时间增加，灰度比值逐渐增大，Caspase-3表达水平升高。

3 讨论

DMF是低毒类有机溶剂，具有肝毒性，能够诱导肝细胞凋亡。研究发现，一定浓度DMF能诱导正常成人离体肝细胞发生凋亡，并且细胞凋亡率随着染毒浓度增加有升高趋势〔3〕。Caspase-3是凋亡效应组重要成员。在蛋白酶级联切割过程中，Caspase-3处于核心位置，被称为死亡蛋白酶〔4, 5〕。由于绝大多数细胞凋亡依赖于Caspase，但也有少数非Caspase依赖的细胞凋亡。本实验结果表明在一定浓度DMF染毒后，Caspase-3酶原可被激活，并产生2条新的亚基条带17和11kDa。100mmol/L的DMF分别染毒3，6和12h，酶原表达水平随着染毒时间的增加有下降趋势，同样，随着染毒浓度增加，Caspase-3酶原表达也有下降趋势。但随着染毒浓度与染毒时间增加，活化的Caspase-3亚基表达逐渐增多，呈较好的时间效应和剂量效应关系。结果表明Caspase-3的激活参与了DMF致人肝细胞的凋亡过程，与冯文明等〔6〕报道一致。

参考文献
〔1〕 宣志强,路艳艳,杨军,等.二甲基甲酰胺致人肝细胞DNA的损伤效应[J].中华劳动卫生职业病杂志,2008,26(5):291-294.
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〔3〕 路艳艳,杨锦蓉,王菁.AO/EB染色法及流式细胞术检测DMF 诱导人肝细胞凋亡[J].浙江预防医学,2007,19(6):11-14.
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〔5〕 郭孝鹏,黄国香,吴青,等.锰对人脐静脉内皮细胞及半胱天冬酶表达影响[J].中国公共卫生,2007,23(1):110-111.
〔6〕 冯文明,朱鸣,鲍鹰,等.δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠肝细胞凋亡及肝组织bcl-2和Caspase-3表达的影响[J].中国普外基础与临床杂志,2009,16(7):550-554.