中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (11): 1392-1393   PDF    
引用本文
张莹, 王彪, 赵久晗, 徐晓雪, 孙黎光. 铅对大鼠星型胶质细胞c-Fos和c-Jun蛋白表达影响[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(11): 1392-1393.
ZHANG Ying, WANG Biao, ZHAO Jiu-han, et al. Effect of lead on expressions of c-Fos and c-Jun in rat primarily cultured astrocyte cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(11): 1392-1393.
铅对大鼠星型胶质细胞c-Fos和c-Jun蛋白表达影响
张莹1,2, 王彪3, 赵久晗1, 徐晓雪1,2, 孙黎光3    
1. 中国医科大学附属第一医院神经内科, 辽宁沈阳110001;
2. 中国医科大学神经病学研究所;
3. 中国医科大学生物化学与分子生物学教研室
收稿日期: 2010-06-10.
基金项目: 国家自然科学基金(39970651)
作者简介: 张莹(1979-),女,沈阳人,讲师,博士,研究方向:神经系统疾病和信号转导研究。
摘要: 目的 探讨不同时间点低浓度铅暴露对体外原代培养的星型胶质细胞中即早基因c-Fos和c-Jun蛋白表达的影响。方法 出生4～8 d Wistar大鼠脑星型胶质细胞原代培养,1.0μmol/L醋酸铅暴露不同时间后分别收集样品,应用蛋白免疫印迹法测定样品c-Fos和c-Jun蛋白表达的变化。结果 1.0μmol/L醋酸铅处理后,星型胶质细胞中c-Fos和c-Jun蛋白表达均明显降低,与对照组比较,染铅15 min时蛋白表达降低有统计学意义(P＜0.05),分别比对照降低33.4%和17.3%;至染铅180 min时c-Fos和c-Jun蛋白表达降至最低,均低于对照的1/2(P＜0.01)。结论 低浓度染铅可使原代培养的星型胶质细胞中c-Fos和c-Jun蛋白表达持续降低,这可能与铅致大鼠学习记忆功能损害有关。
关键词: 铅     星型胶质细胞     即早基因    
Effect of lead on expressions of c-Fos and c-Jun in rat primarily cultured astrocyte cells
ZHANG Ying, WANG Biao, ZHAO Jiu-han, et al     
Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China
Abstract: Objective To observe the effect of low-level of lead on the expression of c-Fos and c-Jun in rat primarily cultured astrocyte cells.Methods The primary neural glia cells of Wistar rats of 1-4 days old were cultured.Samples of the cell culture were collected at different time after 1.0μmol/L lead acetate exposure and the contents of c-Fos and c-Jun were assayed with Western blot method.Results The exposure of 1.0μmol/L lead acetate could decrease the expressions of c-Fos and c-Jun remarkably compared with those of the control.There were 33.4% and 17.3% of decrease in c-Fos and c-Jun expression 15 minutes after the exposure compared to those of the control,respectively(P<0.05).The expressions of c-Fos and c-Jun decreased to the lowest 180 minutes after the exposure and were only 1/2 of the control(P<0.01).Conclusion Low-level lead exposure could result in the persistent decrease of the expressions of c-Fos and c-Jun within several hours and the decreases may relate to the damage of learning and memory capacity in rat with lead exposure.
Key words: lead     astrocyte     immediate early gene    

铅是环境和工业毒物中影响儿童神经发育和学习记忆功能的主要污染因素。尤其在儿童发育期，铅暴露可引起儿童智力缺陷和行为异常〔1〕。在大脑中存在2类神经细胞:即神经元和胶质细胞，后者在脑内占了绝大多数。最新研究结果显示，胶质细胞也同神经元一样具有记忆功能，能产生长时程增强，被认为与脑的信息处理、储存及学习记忆等有关〔2〕。铅对神经元学习记忆功能的影响已有诸多报道，而对星型胶质细胞信号转导的影响报道较少。许多研究证实，在学习记忆过程中均伴有c-fos和c-junmRNA和蛋白水平表达升高，提示诱导海马c-Fos和c-Jun的表达是形成长期记忆的必要条件〔3〕。本实验观察了急性醋酸铅染毒对原代培养的大鼠星形胶质细胞c-Fos和c-Jun蛋白表达的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

出生1～4d的Wistar大鼠(中国医科大学实验动物部)。兔神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体和抗生物素蛋白复合生物素(SABC)免疫组化试剂盒及二氨基联苯氨(DAB)染色试剂盒(武汉博士德生物技术公司);兔c-Fos、c-Jun单克隆抗体(美国Sigma公司)，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗(北京中山生物技术有限公司)，其余试剂为分析纯。

1.2 方法 1.2.1 原代大鼠星型胶质细胞培养及检测〔4〕

取大鼠皮质及海马区脑组织，剪碎，用体积分数为0.125%的胰酶消化，过滤制成单细胞悬液，离心2次，细胞沉淀以含10%灭活胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/营养合剂(F12)培养基悬浮，按2×106个/mL种植在培养瓶中进行差速处理，30min后将细胞悬液倒至另一个预先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，培养9～16d，细胞长满瓶底，每4～9d传1代，传2～4代后进行星型胶质细胞纯度检测。将细胞悬液滴在底部铺有盖玻片的24孔培养板上，待细胞长满后用胶质细胞骨架蛋白GFAP一抗〔阴性对照组用磷酶盐缓冲液(PBS)〕按照SABC试剂盒说明书方法进行免疫组化染色，显微镜下观察结果。

1.2.2 细胞染铅及分组

取处于对数生长期的原代培养星型胶质细胞，于无血清培养基，37℃，5%CO2培养箱中饥饿培养12h，使细胞同步化。醋酸铅溶解于10%FBS的F12/DMEM培养基中，染铅终浓度为1.0μmol/L，按照染铅时间分为0，5，15，30，45、60，120，180min染铅组，对照组与染铅组同步培养，同一时间收集细胞。

1.2.3 蛋白质免疫印记法〔5〕

细胞在预冷的裂解液中超声粉碎后12000r/min、4℃离心1h，上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白。各样品均取等量蛋白30μg，进行十二烷基硫酸钠-聚炳烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，继而转印至硝酸纤维素膜，封闭后分别加入一抗(1∶400稀释)和二抗(1∶10000稀释)，化学发光自显影(ECL)显色系统显色，放射自显影法检测反应信号。电脑扫描蛋白印记，ChemiImager5500V2.03图像分析软件分析灰度值，c-fos和c-jun灰度值与内参β-actin灰度值比值作为该样品表达量。

1.3 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行数据处理，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 星型胶质细胞GFAP免疫组化鉴定(图 1)
图 1 星型胶质细胞GFAP 免疫组化染色( 400 × )

95%以上的细胞胞浆着黄色，胞核着蓝色，表明绝大多数培养的细胞为星型胶质细胞。

2.2 醋酸铅对星型胶质细胞c-Fos蛋白表达影响(图 2)
图 2 1. 0 μmol /L 醋酸铅对星型胶质细胞c-Fos 蛋白表达影响

1.0μmol/L醋酸铅与原代培养的星型胶质细胞共同孵育，染铅15min后c-Fos的表达量开始明显降低，比对照下降33.4%(P＜0.05)。至染铅180min时，c-Fos表达量降至最低，与对照相比较下降55.9%。

2.3 醋酸铅对星型胶质细胞c-Jun蛋白表达影响(图 3)
图 3 1. 0 μmol /L 醋酸铅对星型胶质细胞c-Jun 蛋白表达影响

1.0μmol/L醋酸铅与原代培养的星型胶质细胞共同孵育，染铅15min后c-Jun的表达量开始明显降低，比对照下降17.3%(P＜0.05)。至染铅180min时，c-Jun表达量降至最低，与对照相比较下降58.1%。

3 讨论

以往认为星型胶质细胞是动物脑中大量存在的仅对神经元起支持和营养作用的细胞，但近期有研究证实，星型胶质细胞也同神经元一样具有记忆功能，能产生长时程增强(LTP)，与脑的信息处理、储存及学习记忆等有关〔2〕。以c-fos和cjun为代表的即早基因(immediateearlyexpressiongene，IEG)是一类可被第二信使诱导激活的原癌基因，具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变偶联起来的效应〔6〕。Dong等〔7〕研究表明，脑组织中c-fos和c-Jun的表达与神经细胞的发育、神经活动、学习记忆过程或LTP形成有关。但有关铅染毒影响c-fos和c-jun表达的机制目前尚不清楚。

本研究结果显示，急性铅染毒可能间接阻碍了c-fos和cjun基因的反应性表达，使其产物c-Fos和c-Jun蛋白水平降低。本课题组前期研究发现〔8, 9〕，c-fos和c-junmRNA水平的变化规律与各组小鼠学习记忆能力的变化一致，说明c-fos和c-jun基因表达状况的变化可能是慢性铅染毒导致小鼠学习记忆能力下降的重要中间环节。该结果也表明，铅对c-Fos和c-Jun蛋白表达的影响可能是造成学习记忆功能障碍的分子机制之一。

参考文献
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