近年来研究表明，自然界中的某些细菌具有浮游态和生物膜2种生存方式^〔1〕。浮游态细菌指单独存在细菌个体，生物膜细菌指集聚生长的细菌群落和细胞外基质构成的集合体。生物膜细菌在形态结构、生理生化特性以及致病性等方面与浮游细菌有很大差异^〔1〕。铜绿假单胞菌是医院内感染的常见条件致病菌，临床研究发现，在铜绿单胞菌感染性疾病中，大多数是由铜绿假单胞菌生物膜所致^〔2〕。本研究探讨铜绿假单胞菌生物膜与浮游态铜绿假单胞菌致病性差异，为生物膜铜绿假单胞菌感染性疾病的防治提供依据。

60只Hartley品系健康豚鼠(浙江省医学科学院实验动物中心)，许可证号SCXK(苏)2009-0005，雌雄各半，体重(310±20)g。随机将豚鼠分为生物膜组、浮游菌组和对照组3组，每组雌、雄各10只。

本实验使用的菌株均为本室保存菌株^〔3〕，其中生物膜组使用的铜绿假单胞菌临床分离株PA12能形成生物膜(A570=0.706)，浮游菌组使用的铜绿假单胞菌临床分离株PA26不能形成生物膜(A570=0.095)。硅胶管(华东医药公司);胰蛋白胨和酵母提取粉(英国OXOID公司);其他试剂(上海生物工程公司)。

PA12和PA26菌株复苏后分别包被硅胶管(0.6mm×10mm)，对照组硅胶管用无菌生理盐水浸泡。豚鼠腹腔注射盐酸氯胺酮麻醉，切开气管后分别植入硅胶管(生物膜组用PA12包被、浮游菌组用PA26包被、对照组用生理盐水浸泡)，常规饲养15d，豚鼠腹腔注射盐酸氯胺酮麻醉，经气管插入7号头皮针，生理盐水灌洗收集支气管肺泡灌洗液(BALF);取左肺组织称重后匀浆;取右肺和支气管组织用10%甲醛固定，待检。

平板稀释法测量BALF及肺组织匀浆中活菌数目^〔4〕;常规法分离铜绿假单胞菌并进行鉴定^〔5〕，微孔法测定分离菌株的生物膜形成能力^〔6〕，每个菌落进行平行3孔测量，以平均A570值代表该菌落的生物膜形成能力。每个标本测定3个独立菌落，取平均A570值，若该平均值大于阳性标准菌株的A570平均值，则判断该标本分离的铜绿假单胞生物膜形成能力为阳性^{〔3, 6〕}。

豚鼠右肺和支气管组织标本，石蜡包埋切片，苏木素伊红(HE)染色，光镜观察组织形态改变。

应用SPSS 13.0软件对数据进行分析，均数比较采用t检验，率的比较采用χ²检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

生物膜组豚鼠72h死亡率为10%(2/20)，浮游菌组死亡率为30%(6/20)，差异无统计学意义(P＞0.05)。生物膜组18只存活豚鼠中有12只肺组织呈明显萎缩、质硬、形态不规则、弹性明显减退及胸膜黏连，其余6只无明显异常。对照组和浮游菌组肺组织肉眼观察无明显异常。生物膜组豚鼠肺组织慢性感染发生率为66.7%(12/18)，浮游菌组为0(0/14)，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表 1

表 1 豚鼠BALF 和肺组织细菌计数结果(±s)

表 1 豚鼠BALF 和肺组织细菌计数结果(±s)

表 1显示，生物膜组BALF和左肺匀浆的细菌总数明显低于浮游菌组(P＜0.01)。对照组豚鼠BALF和左肺匀浆中未见细菌生长。

生物膜组(n=12)BALF和左肺分离的铜绿假单胞菌A570分别为(0.712±0.06)和(0.716±0.059)，均能形成生物膜。浮游菌组死亡豚鼠(n=6)BALF和左肺分离的铜绿假单胞菌不能形成生物膜，A570分别为(0.084±0.014)和(0.093±0.015)。浮游菌组存活豚鼠以及对照组豚鼠左肺和BALF未分离出铜绿假单胞菌。

图 1

注: A: 生物膜组( 肺) ，B: 生物膜组( 支气管) ，C: 浮游菌组( 肺) ，D: 浮游菌组( 支气管) 。图 1 存活豚鼠肺及支气管组织形态学检查( HE 染色，100 × )

图 1显示，生物膜组肺组织异常豚鼠肺泡腔内纤维渗出、间隔炎性细胞浸润(图 1-A)，纤毛上皮增生、黏膜下淋巴细胞浸润(图 1-B)。浮游菌组存活豚鼠肺和支气管组织形态未见明显异常，肺泡大小及间隔正常、肺泡腔内无渗出(图 1-C)，纤毛上皮、黏膜层及黏膜下层正常(图 1-D)。

细菌吸附在机体腔道内膜、黏膜或惰性物体表面后，分泌多糖及糖蛋白复合物，细菌粘连成团块，即为生物膜。与普通浮游态细菌比较，生物膜内细菌代谢减缓，抵抗力及生存能力增强，是重要的感染源^〔7〕。

本研究观察到铜绿假单胞菌生物膜感染豚鼠后，66.7%的存活豚鼠患有下呼吸道慢性感染，而普通浮游态细菌感染组豚鼠未发生下呼吸道慢性感染。表明铜绿假单胞菌生物膜是下呼吸道慢性感染的高危因素。生物膜引起的下呼吸道慢性感染豚鼠，其支气管及肺组织病理改变与大鼠生物膜感染类似^〔8〕。本文从下呼吸道慢性感染豚鼠体内分离到能形成生物膜的铜绿假单胞菌，证实了豚鼠慢性感染是由生物膜细菌引起。下呼吸道慢性感染豚鼠BALF及肺组织细菌总数介于10³～10⁴cfu/mL(或cfu/g)，这与大鼠生物膜感染结果一致^〔9〕。该指标可用于诊断生物膜感染性疾病。