中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (11): 1357-1359   PDF    
引用本文
张辉, 喻莉萍, 李旭, 黄常洪, 胡吉林, 姚飞虹, 李强国. La(Sal)2(Qu)对重组Fas基因酵母促凋亡作用[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(11): 1357-1359.
ZHANG Hui, YU Li-ping, LI Xu, et al. Apoptosis induced by La( Sal)2(Qu) in S. pombe with recombinant Fas gene[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(11): 1357-1359.
La(Sal)2(Qu)对重组Fas基因酵母促凋亡作用
张辉1, 喻莉萍2, 李旭1, 黄常洪3, 胡吉林1, 姚飞虹1, 李强国1     
1. 湘南学院化学与生命科学系药学教研室, 湖南郴州423000;
2. 湘南学院图书馆;
3. 湖南省郴州市第一人民医院检验科
收稿日期: 2010-01-26.
基金项目: 国家自然科学基金(20973145/B0309);湖南省科技厅科技计划项目(2008FJ4186);湖南省自然科学基金(08JJ3014/B030805);湖南省教育厅科技处项目(04C635)
作者简介: 张辉(1969-),男,湖南耒阳人,教授,博士,研究方向:肿瘤药理学与毒理学。
通讯作者: 李强国
摘要: 目的 观察氯化镧水杨酸8-羟基喹啉三元稀土配合物〔La(C7H5O3)2·(C9H6NO)〕,对重组Fas基因酵母的促凋亡作用。方法 抽提Jurkat细胞RNA;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)制备Jurkat细胞的cDNA;PCR扩增人Fas基因;将人Fas基因克隆到pREP3X-HA质粒中构建pREP3X-HA-Fas穿梭载体,电转化穿梭载体到野生型粟酒裂殖酵母细胞中;应用蛋白印迹法(Western blotting)鉴定蛋白表达产物;应用La(Sal)2(Qu)诱导重组Fas酵母产生凋亡应答。结果 经原位末端标记(TUNEL)法显微计数检测发现,对照组细胞膜泡形成、细胞核碎裂和细胞核溶解的细胞各占计数细胞总数的2.80%、3.74%和2.80%,而处理组分别为26.67%、22.86%和13.33%,差异有统计学意义(P＜0.01);流式细胞术检测发现,对照组细胞凋亡检出率为1.24%,而处理组为50.17%,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 La(Sal)2(Qu)可能通过Fas诱导酵母细胞凋亡。
关键词: 氯化镧水杨酸8-羟基喹啉三元稀土配合物〔La(C7H5O3)2·(C9H6NO),La(Sal)2(Qu)〕     粟酒裂殖酵母     Fas     基因表达    
Apoptosis induced by La( Sal)2(Qu) in S. pombe with recombinant Fas gene
ZHANG Hui, YU Li-ping, LI Xu, et al     
Department of Pharmacology, School of Chemistry and Life Science, Xiangnan University, Chenzhou 423000, China
Abstract: Objective To observe the apoptosis induced by La(C7H5O3)2·(C9H6NO)in recombinant yeast.Meth-ods Total RNA of Jurkat cells was extracted by TRIZOL reagent.First-strand cDNA of Jurkat cells was synthesized by RT-PCR.The Fas genes were amplified by PCR and cloned into plasmid and formed a relevant shuttle carrier.The pREP3X-HA-Fas shuttle carriers were transformed into wild-type Schizosacharomyces pombe(S.pombe)by electroporation.The active recombination was identified by Western blotting and the apoptosis induced by La(C7H5O3)2·(C9H6NO)was observed.Results The ratio of the bubble of cellular membrane,the fragmentation and caryolysis of cell nucleus induced by La(C7H5O3)2·(C9H6NO)were 26.67%,22.86%,and 13.33%,respectively,detected with terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling in treated group with significant differences compared with those of the control group (2.80%,3.74%,and 2.80%,respectively,P<0.01 for all).The apoptosis rate increased in treated group compared with that of the control group detected by flow cytometry(50.17% vs 1.24%,control group vs treated group,P<0.01).Conclusion La(C7H5O3)2·(C9H6NO)could induce apoptosis by Fas in S.pombe.
Key words: La(C7H5 O3)2·(C9H6 NO)     S.pombe     Fas     gene expression    

Fas是近年来研究最为深入的有关细胞凋亡的膜表面分子，研究Fas在凋亡中的作用机制，对了解细胞凋亡有重要意义。酵母作为一种容易进行操作的生物模型，广泛应用于异基因表达、结构与功能和细胞的凋亡研究中〔1, 2〕。氯化镧水杨酸8-羟基喹啉三元稀土配合物［La(Sal)2(Qu)］具有抗真菌和细菌作用，也具有促细胞凋亡作用〔3〕，为了探讨La(Sal)2(Qu)促凋亡的作用机制，本研究课题在粟酒裂殖酵母中表达Fas并观察了对酵母存活的影响，分析了La(Sal)V2(Qu)对不同凋亡通路之间的相互作用关系。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 菌株和质粒

大肠埃希菌菌株DH5α，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe，S.pombe)菌株leu-ura-h+，表达质粒pREP3X-HA(haemagglutinin，HA血细胞凝集素)，Jurkat细胞均由西班牙萨拉曼卡大学的FaustinoMollinedo教授赠送。pREP3X-HA质粒含nmt1启动子、HA和his3基因，nmt1启动子可以通过硫胺素调节表达，HA基因编码血细胞凝集素抗原决定簇。

1.2 酶和试剂

限制性内切酶(美国MBIFermentas公司)，Taq酶、脱氧核苷酸(dNTPs)、DNAmarker、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG)、胶回收试剂盒(SK1131)和PCR引物(上海生工生物工程有限公司);连接酶和DeadEndTMFluorometricTUNELSystem试剂盒(美国Promega公司);抗HA抗原决定簇抗体、抗Fas抗体，羊抗鼠HRP抗体、羊抗兔HRP抗体(美国Pierce公司);其他试剂均为市售分析纯。

1.3 Fas基因的合成与克隆 1.3.1 Jurkat细胞Fas基因的合成

应用酚-氯仿抽提法〔4〕 制备Jurkat细胞RNA，然后应用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR) 合成其cDNA，以该cDNA为模板经PCR合成Fas基因。

1.3.2 Fas基因的克隆和鉴定

4%琼脂糖电泳PCR产物，回收目的条带，按照SK1131胶回收试剂盒说明书回收目的 片段，与T载体连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂布在带 有半乳糖苷(X-gal)和(IPTG)的氨苄平板上，挑选白斑克隆，提取质粒后，分别用SalI和NotI单酶切验证为阳性克隆后，送上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 pREP3X重组质粒载体的构建和鉴定

pREP3X-HA质 粒与Fas基因克隆和转染参考本实验室以前的方法〔5〕。重组 质粒命名为pREP3X-HA-Fas。

1.5 裂殖酵母的转化和鉴定 1.5.1 酵母的转化

参考文献〔6〕的方法进行电转化。转化 条件为:1.5kV，132Ω，40μF。

1.5.2 转化子的鉴定

转化平板上挑取单菌落，接种于Edinburgh minimalmedium(EMM)基本培养基培养至A5951.0左 右，取菌液1.5mL，离心(3000g)10min收集细胞，重悬于 STET缓冲液(8%蔗糖，5 %TritonX-100，50mmol/L乙二胺 四乙酸二钠盐和50mmol/LTris-HCl，pH8.0)100μL，短暂振 荡后热水浴加热3min;冰上降温数秒，离心，上清转移，加入 醋酸铵(7.5mol/L)50μL，-20℃存放1h后离心;上清转 移，加入2倍体积乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，加水溶解。 10μL提取的DNA转化感受态大肠埃希菌DH5α，过夜培养 后，挑取单菌落，液体培养，提取质粒，电泳，与pREP3X-HAFas 比较大小。

1.6 蛋白表达产物的鉴定

将未转化的酵母、pREP3X-HA 质粒转化的酵母和pREP3X-HA-Fas重组质粒转化的酵母在 EMM培养基中于32℃培养。参考文献〔7〕方法，分别提取各 组转化酵母细胞蛋白后，取30μg蛋白进行十二烷基磺酸钠 (sodiumdodecylsulfate，SDS)凝胶电泳将蛋白进行分离后，将 其转移至硝化纤维上，用抗HA抗原决定簇抗体或抗Fas抗 体作为一抗，应用羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)或羊抗兔 HRP作为二抗，按试剂盒说明进行操作，染色蛋白条带，并进 行拍照。

1.7 表达产物活性的鉴定

将酵母细胞分为3组(野生型酵 母对照组，重组酵母对照组和重组酵母处理组)，处理组细胞 生长于含有2%半乳糖的MM(minimalmedium)液体培养基 中，并加入2.0μmol/L的La(Sal) 2 (Qu)处理6h以诱导粟酒 裂殖酵母产生凋亡应答〔5〕。而对照组则未经La(Sal) 2 (Qu) 处理。处理结束后，对细胞分别进行原位末端标记(TUNEL) 试验和碘化丙锭(PI)染色法流式细胞术检测〔5〕。

1.8 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行统计，计数资料组间差异用 单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Fas基因的扩增

PCR产物电泳后，大小为1007bp左 右，连接到T载体上，经上海生工生物工程有限公司测序，序 列正确。

2.2 穿梭载体的构建

连接产物的转化菌，提取质粒经SalI 和NotI酶的单酶切和双酶切，同时以pREP3X-HA为对照，酶 切产物进行琼脂糖电泳。电泳结果表明，双酶切片断长度约 为1007bp左右，大小与Fas基因相当，表明Fas基因已被克 隆至该位点。酶切验证阳性的重组质粒，经上海博亚测序，序 列正确。

2.3 酵母转化子的鉴定

从酵母转化子提取的质粒，转化大 肠埃希菌扩增后，与pREP3X-HA-Fas同时进行电泳试验，比 较质粒大小。电泳结果表明，酵母质粒与重组质粒大小一致。

2.4 蛋白表达产物的鉴定(图 1，2)
注: M-DNA 分子量标准; 1: S．pombe 野生型; 2: 转录了HA 基因的S．pombe; 3: 转录了HA和Fas基因的S．pombe。图 1 粟酒裂殖酵母细胞蛋白表达产物HA 表达图谱

注: M-DNA 分子量标准; 1: S．pombe野生型;2: 转录了HA 基因的S．pombe; 3: 转录了HA和Fas基因的S．pombe。图 2 粟酒裂殖酵母细胞蛋白表达产物Fas 表达图谱

在表达产物鉴定试验 中可以看出，在未转化的酵母细胞中，未检测到HA和Fas的 表达;在转化了pREP3X-HA质粒的酵母细胞中，检测到了 HA的表达，但未检测到Fas的表达;在转化了pREP3X-HAFas 重组质粒的酵母细胞中，既检测到HA的表达，也检测到 了Fas的表达。提示外源基因得到了表达。

2.5 表达产物活性的鉴定

重组酵母对照组正常细胞占计 数细胞总数的90.65%，发生了细胞膜泡形成、细胞核碎裂和 细胞核溶解的细胞各占计数细胞总数的2.80%，3.74%和 2.80%;重组酵母处理组细胞正常细胞占计数细胞总数的 37.14%，而发生了细胞膜泡形成、细胞核碎裂和细胞核溶解 的细胞各占计数细胞总数的26.67%、22.86%和13.33%。2 组经χ 2检验，差异有统计学意义(P＜0.01)。PI法流式细胞 术凋亡检出率，重组酵母对照组为1.24%，重组酵母处理组 为50.17%，二者差异有统计学意义(P＜0.01)。野生型酵母 对照组TUNEL法显微计数凋亡率为9.82%，PI法检出率为 1.32%，与重组酵母对照组比较，差异无统计学意义。

3 讨 论

凋亡是一种程序性细胞死亡，对生物体维持内环境稳定 和多细胞生物的生存起重要作用〔8〕。机体在清除自反应免 疫细胞、病毒感染细胞和不可修复的、有恶性转化危险的遗传 损伤细胞时都会发生凋亡。凋亡是一个由许多调节物质和效 应物质组成的复杂网络，可被各种毒素或外来信号(如乙醇、 活性氧自由基(ROS)、各种受体的配体等)、各种细胞内活动 (如有丝分裂缺陷、修复失败)所激活。几乎所有的凋亡过程 在其最后阶段都具有独立的调节通路，凋亡具有典型的生物 化学和形态学标志，这些标志包括含半胱氨酸的天冬氨酸酶 (caspase)激活，膜气泡化，核DNA碎片形成和细胞皱缩〔8〕。 在本研究中PI法凋亡检出率重组酵母处理组为50.17%，低 于TUNEL法。其检出率低的主要原因可能是由于TUNEL法 比较主观，且计数的细胞数只有100个左右，容易产生偏差。 次要原因可能是由于TUNEL法无法很好地鉴定凋亡和坏死，因此可能导致假阳性的产生。比较2种方法的凋亡检出率，差异无统计学意义，说明2.0μmol/L的La(Sal) 2 (Qu)处理6 h后，细胞以凋亡为主，坏死不严重。

参考文献
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