化学发光免疫检测技术因为既具有免疫反应的特异性又具有化学发光反应的高灵敏性,而被许多领域广泛的应用^〔1〕,特别是在临床免疫检测中已占主导地位。自免疫检测技术问世及在其迅速发展过程中,高效固相载体的选择始终是研究热点之一。近年来,在新型固相载体中,磁性微球因其既可以作为反应的固相载体又可以作为分离载体,与传统的酶标板载体比较,在应用过程中具有更大的反应表面积,从而提高抗体/抗原分子的反应效率,同时具有可自动化操作等优势。目前,国际上已经有商业化的磁性微球广泛地应用于免疫检测中^〔2〕。本研究以自制的磁性微球作为免疫检测的固相载体,以人绒毛膜促性腺激素(hCG)为待检测物质,建立基于磁性微球的化学发光免疫检测方法。

自制磁性微球,Merck Carboxy-lModified ParaMagnetic Microspheres (-COOH),Pierece SuperSignal Pico化学发光底物,α-hCG和β-hCG抗体(杭州隆基生物技术有限公司);HRP-标记的α-hCG[百奇生物科技(上海)有限公司进行酶标];朗道人质控标准血清(正常水平);hCG抗原(中国药品生物制品检定所)。

(1)活化:以0.11 mol/L的磷酸基缓冲液(PBS,pH=7.2)和0.5 mol/L氨基己酸溶液和 0.05 wt%的吐温混合液作为活化洗涤液。取2 mg的磁性微球加入200 μL的活化洗涤液,洗涤3次。分别各加入2 mg 的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS),室温混匀反应 15 min;(2)偶联:以0.05 mol/L磷酸缓冲液和0.05%吐温的混合液(PBT,pH=7.2)作为偶联洗涤液。用200 μL的偶联洗涤液洗涤已活化的磁球1次。加入hCG抗体,室温反应2 h;(3)封闭:用偶联洗涤液洗涤已偶联后的磁球3次。加入 200 μL含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.3%甘氨酸(Gly) 的偶联洗涤液,室温反应45 min;(4)保存:用偶联洗涤液洗涤已封闭的磁球3次。加入200 μL含有2% BSA的偶联洗涤液,放入4度冰箱保存待用。

免疫磁性微球制备过程中,当偶联操作结束后,在外加磁场的作用下,得到包被后的蛋白上清液,并将其在10 000 r/min离心10 min去除少量未被磁场吸附的磁球。然后,按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒的操作要求建立蛋白浓度的标准曲线,同时测试包被前加入的抗体蛋白浓度以及包被后上清夜中蛋白浓度,最后通过差减法计算得到磁性微球上包被的抗体量。

取30 μg的免疫磁性微球,加入20 μL的待检测抗原溶液和100 μL的酶标抗体溶液,室温混匀10 min,37 ℃水浴反应1 h。反应结束后,弃上清,用 Tris-HC l0.02 mol/L (pH=7.4)洗涤5次,去上清,加入100 μL 的发光底物,混匀1 min,避光放置5 min后,上机检测。

本实验室制备的磁性微球为表面经羧基改性的氧化硅磁性微球,微球内部有大量10 nm左右的Fe₃O₄颗粒弥散在其中,表面为经羧基改性的氧化硅壳层,表面的羧基含量为0.1 mmol/g磁珠。通过动态光散射激光粒度仪测定,得到磁性微球的水力学尺寸为1 180 nm,且粒径单分散性较好。

通过调节磁性微球表面包被抗体量对检测本底与抗原浓度为1 000 m IU/mL的检测信号影响进行研究。结果表明,随着免疫磁球表面包被抗体量的增加,不同hCG浓度梯度的检测信号也相应提高。但当每毫克磁球表面包被抗体量< 12 μg 时,信号随抗原浓度梯度上升而提高得不明显。这可能是由于磁球表面包被抗体量不足以完全捕获体系中的所有抗原而造成的。由此,选择在每毫克磁球上包被12 μg抗体的免疫磁球作为检测的固相载体。

免疫磁球的加入量为10,30,50,70 μg时,检测发光值分别为8 931 476,11 533 247,11 845 437,11 330 407,实验结果表明,在高抗原浓度 (1 000 m IU/mL)的情况下,当免疫磁球的加入量高于 30 μg时,检测信号无明显的变化。表明检测体系中的包被抗体已足量。因此,选择加入30 μg的免疫磁性微球作为反应的固相载体。

在本研究中,采用的是抗α-hCG的酶标抗体,其原始浓度为5.63 mg/mL。结果表明,当抗原浓度为1 000 mIU/mL,酶标抗体稀释倍数> 10 000倍时,检测信号随着酶标抗体稀释倍数的增加而明显降低。因此,在检测过程中选择将酶标抗体稀释10 000倍进行检测。

结果表明,随着反应时间的延长,在各个抗原浓度下的检测信号都逐步增强,但随着时间的延长,信号增强的幅度降低。在37度的条件下反应30 min,与反应60 min比较,其信号强度达到后者的 80%左右。继续增加反应时间,到达45 min时,与反应60 min 比较,检测信号增至后者的90%左右。由于反应30 min可以完成大部分的反应,本研究选择抗原抗体反应时间为 30 min。从而保证整个化学发光免疫检测的过程只需 45 min即可完成。

研究建立检测方法的实验精密度并与进口商业化的M erek磁性微球检测结果比较。从表 2可见,本实验室制备的磁性微球在批间与批内误差上面,与进口商业化的磁性微球基本一致。甚至在高抗原浓度时,基于本实验室磁性微球建立的化学发光免疫检测方法得到的检测结果批内、批间误差分别为2.57%和7.7%,低于进口商用磁性微球的4.41%和11.89%。表明本实验室建立的方法一致性较好。另外,从表中数据还可看出,采用本实验室制备的磁性微球的信号检测强度高于进口商用磁性微球,而本低信号强度却低于进口商用磁性微球,因而显示出自制磁性微球具有更好的检测性能。

建立对空白孔进行8次重复测定,并计算其偏差,得出其最低检测限为1.43 mIU/mL,因而其生物灵敏度为2.11 mIU/mL^〔4〕。根据免疫检测功能灵敏度计算方法可知,本研究建立的磁性微球化学发光免疫检测的功能灵敏度为0 mIU/mL,线性范围是0~750 mIU/mL。

结果表明,在本检测系统中,当血清样品中的hCG抗原浓度> 2 280 mIU/mL 时,检测信号出现假低值,即出现(HOOK)效应。继续增大血清样品中hCG抗原的浓度到11 400 mIU/mL,检测信号并未出现假阴性。

磁性微球作为免疫检测的固相载体具有操作简便,参与反应比表面积大,实验时间短等优点。本研究利用本实验室制备表面羧基改性的氧化硅磁性微球,以hCG为待检测物,建立了基于磁性微球的化学发光免疫检测法。本文结果表明,自制磁性微球可作为固相载体应用于磁性化学发光免疫检测中,并且实验结果的批间、批内误差较小,仅需45 min即可完成对样品中hCG抗原的检测。

目前,磁性微球已经广泛作为商业化放免、酶免和化学发光免疫检测的固相载体,Amersham^〔5〕等公司也开发相应的磁性微球。本研究选择进口商业化的Merck磁球微球作为参照对象,评价自制磁球在化学发光免疫检测中的应用效果。结果表明,自制磁球在已建立的化学发光免疫检测体系中具有更低的检测本底和更宽的检测范围,提示本实验室制备的磁性微球在化学发光免疫检测体系中具有一定的应用前景。

(感谢上海交通大学医学院上海市医学检验重点试验室的郑佐娅副教授在实验期间给予指导与帮助)