慢性乙型肝炎(乙肝)是一种由HBV感染引起的以局部单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞浸润为主的感染性疾病。 ELR⁺CXC趋化因子由多种免疫细胞如单核-巨噬细胞、T淋巴细胞及中性粒细胞以及HBV感染的肝细胞等分泌,主要趋化中性粒细胞、调节新生血管生成,引起部分肝细胞损伤,介导局部炎症细胞浸润^〔1〕。为保护肝细胞不受过度损伤,肝细胞自身可表达一些免疫抑制分子,通过与相应的受体或配体结合,形成免疫抑制途径,抑制宿主的抗病毒免疫应答,使病毒在体内持续复制,病程慢性化。现就慢性乙肝患者ELR⁺CXC趋化因子及其受体表达的国内外研究进展进行综述。

IL-8亦被称为人嗜中性白细胞活化蛋白-1(NAP-I),是最早被发现的含有ELR序列的CXC 趋化因子。IL-8编码基因3~10 C定位于人第4号染色体 (q12~q21),由4个外显子和3个内含子组成,在IL-8基因 5c-非编码区的-20至-13位有TATA盒结构,人嗜中性白细胞活化蛋白-1在-100至-90位有CAT样结构,在CAT 样结构上游有激活因子-1(AP-1)、激活因子-2(AP-2)、 肝细胞核因子、糖皮质激素类固醇反应成分(GRE)等多种核因子结合位点。其碱基序列和PE4、BTG及IP-10有高度的同源性^〔2〕,开放阅读框(ORF)编码一个99个氨基酸的多肽,其中包括N端的信号肽。由于在N端剪接存在差异,成熟的 IL-8有多种分子,最常见的是含72和78个氨基酸残基的多肽。近年来发现,IL-8不但对中性粒细胞有趋化作用,还对T细胞、单核细胞等有趋化作用。可促进新血管生成,使细胞保持迁移能力并为血管翳形成提供氧。多种免疫细胞如单核-巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞以及 H BV感染的肝细胞等均能分泌IL-8细菌脂多糖(LPS)、白细胞介素(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)可刺激其大量表达。IL-8可通过激活其受体CXCR1或CXCR2直接促进病毒复制,亦可通过减少IFN-A抗病毒活性而间接促进病毒复制,其对IFN-A抗病毒活性的抑制与2c,5c-寡腺苷酸合成酶的减少有关,此酶在IFN的抗病毒活性中起重要作用。因此,H BV感染中IL-8的高表达可引起细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)的聚集,直接作用或介导肝细胞和肝内人的巨噬细胞聚集,从而构成肝细胞损伤的免疫病理基础。 2002年,Sh in等^〔3〕通过核糖核酸酶保护分析法(RN ase pro tection assays,RPA)对10例乙例肝炎病毒感染相关肝癌细胞系中细胞因子及趋化因子水平进行检测,在所有的肝癌细胞系中均未检测到IL-10、IL-12、IFN-γ及IFN-α的mRNA,但在8 例肝癌细胞系中可检测到IL-8 mRNA的表达,在7例肝癌细胞系中可检测到单核细胞趋化蛋白(moncy te chem otactic protein,MCP-1)表达。

GRO是一类与细胞生长相关的ELR⁺CXC族趋化因子,包括GROα、GROβ、GROγ,系统命名分别为CXCL1、CXCL2、CXCL3。小鼠和大鼠的相对应基因分别为KC、CINC。人GRO基因定位于4q21,紧密连锁,由 4个外显子和3个内含子组成^〔4〕。成熟的GRO cDNA编码73 个氨基酸,含ELR序列,其中GROβ、GROγ与GROα分别有9 个和11个氨基酸的差异,这种差异多为保守性替换。GRO 与其他ELR⁺CXC族趋化因子如IL-8、NAP-2上皮细胞源性中性粒细胞活化蛋白-78(ENA-78)等具有较高的同源性。 GRO单体含有一个不规则的柔韧的氨基端,一个环区以及3 股反向平行B链构成B片层,并在此阶段形成一个A螺族; 二聚体则构成一个6条链的反向平行的B片层,2个A螺旋在二聚体的交界处,生理状态下GRO是以单体的形式存在的^〔5〕。GRO的受体均为CXCR2,其中GROα与CXCR2结合力最强。CXCR2和GROα、GROβ、GROγ广泛分布于肝脏组织中,表达在活化的肝细胞、枯否细胞、活化的星形细胞和内皮细胞表面。很多肝脏疾病均可诱导GRO、KC及CINC的表达。肝脏的缺血再灌注损伤能诱导TNF-α及KC、CINC的表达升高;PDGF (plate let-deserved growth factor)刺激巨噬细胞或 LPS刺激成纤维细胞可诱导其GRO的表达。GRO可以促进肿瘤细胞的生长,Loukinova等^〔6〕以GRO基因转染鳞癌细胞,发现转染后癌细胞的生长和转移能力均增强,而且肿瘤周围有白细胞和CD31⁺血管细胞的浸润,这种浸润与GRO的表达呈正相关。GRO还可刺激正常上皮细胞、内皮细胞的生长。有研究表明,抑制枯否细胞的功能或免疫中和KC (小鼠体内的GRO)可以减少小鼠肝脏内中性粒细胞的浸润从而减轻肝脏损害。

从IL-1β和TNF-α处理的上皮细胞中分离获得,其结构与IL-8相似,同属ELR⁺CXC亚族趋化因子,由78 个氨基酸组成,相对分子量为83000。在LPS、IL-1、TNF-α等的刺激下,高度表达于肝细胞、上皮细胞、枯否细胞以及子宫内膜细胞等。与IL-8不同的是,ENA-78只与CXCR2特异性结合。酒精性肝炎患者体内的肝细胞上ENA-78高度表达,并且与肝脏环死性炎症程度有关。有研究表明,IFN-γ可通过降低肝脏ENA-78的表达,减少中性粒细胞在肝脏的局部浸润而减轻肝脏损伤;当肝叶部分手术切除后,肝脏中ENA-78水平明显升高,免疫中和ENA-78,可降低肝脏的再生能力,提示ENA-78与肝细胞再生能力密切相关^〔7〕。Colletti 等^〔8〕在实验小鼠进行70%肝脏切除手术后,采用EL ISA法检测术后1,6及12 h实验小鼠血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)、 TNF、ENA-78水平,发现ALT在整个过程中均明显升高,TNF 在术后1,12 h均升高,ENA-78在术后1,6 h均升高。随后,采用抗-TNF处理小鼠,发现ENA-78在术后6 h明显下降,提示TNF可诱导ENA-78的表达。

NAP-2由血小板衍生前体蛋白通过蛋白质水解形成,由70个氨基酸残基组成。这些前体同源分子包括由 94个氨基酸残基组成的血小板碱性蛋白(PBP)和85个氨基酸残基组成的结缔组织激活肽Ⅲ(CATPⅢ),可通过单核细胞和中性粒细胞蛋白酶降解N末端得到。其结构与NAP-1结构相似,同属ELR⁺CXC亚族趋化因子,对中性粒细胞具有趋化作用。成熟的NAP-2可以刺激嗜中性粒细胞发生趋化游走、分泌溶酶体酶及次级颗粒和增加粘附受体的表达等生物学作用^〔9〕。2008年,He等^〔10〕将81例乙型肝癌患者分成治疗组(33例)和检测组(48例),与33例健康人群做对照,采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDL-TOF-MS)检测血清蛋白质组,采用基本编程系统(BPS)对蛋白质进行分类,研究发现慢性乙型肝癌患者可表达6种特异性蛋白质.其中 NAP-2可作为乙型肝癌患者的一种特异性蛋白质标记。

GCP-2是从MG-63 骨肉瘤细胞分离获得的CXC趋化因子,由75个氨基酸残基组成的分子量为5-6kD的小分子蛋白,氮基酸序列分析显示其与ENA78同源性高达77%。Singh等^〔11〕从鼠成纤维细胞和上皮细胞分离出鼠源性GCP-2,通过基因序列分析发现其与人源性GCP-2的同源性高达61%,但鼠GCP-2较人GCP-2 对中性粒细胞具有更强的趋化作用和促进明胶酶B释放的能力。Northernblot分析结果表明,IL-1B或dsRNA可诱导成纤维细胞GCP-2 mRNA表达水平升高,高水平的GCP-2进一步诱导中性粒细胞内Ca+浓度瞬间短暂升高,采用细胞转染技术将CXCR1和CXCR2转染至293细胞中,可诱导该细胞 C a+升高并趋化其游走.这种作用可通过IL-8、GROα和ENA- 78预处理中性粒细胞或CXCR1和CXCR2转染的293细胞被拮抗或抑制,进一步提示人GCP-2是通过与其受体CXCR2和 CXCR1结合,主要趋化中性粒细胞的游走,但对单核细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞等趋化游走能力较弱。GCP-2除了可诱导中性粒细胞的趋化和激活,在脓毒症、急性呼吸窘迫综合症、急性过敏性反应、自身免疫性疾病中可引起机体组织的损伤,同时还可影响分泌GCP-2的肿瘤细胞的侵袭力^〔12〕。

趋化因子受体是在中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞和上皮细胞、成纤维细胞等结构细胞表面表达的具有7次跨膜域的受体,属G蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员,是介导相应趋化因子发挥生物学功能的关键配体。与ELR⁺趋化因子结合的相关受体主要为CXCR l、CXCR2,它们并非一一对应结合,但都能通过G-蛋白进行级联信号传导,引起表达相应受体的靶细胞发生迁移、脱颗粒等一系列生物学效应,在机体抗感染、抗病毒等多种炎性疾病中发挥重要作用。

CXCR1、CXCR2均属G蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员,只含一条肽链的糖蛋白,长约350个氨基酸,具有7个富含疏水氨基酸的跨膜区结构(STR)。STR有一个胞外氨基端、一个胞内氨基端及呈A螺旋的穿膜区。其N端在细胞外侧(有不同的糖基化),C端在细胞内侧,包含丝氨酸和苏氨酸残基,有利于受体的磷酸化。由于多肽链7次穿过细胞膜,所以形成3个包膜外环和3个胞浆环,其胞浆面的第2个或第3 个细胞内环与异源三聚体G蛋白相偶联。CXCR1首先由 Holmes等^〔13〕成功克隆。CXCR.cDNA是由1个开发读码框编码的350个氨基酸的蛋白,包含1个糖基化的N-端和.个具有7次跨膜域的G蛋白偶联受体。CXCR2由Murphy 等^〔14〕成功克隆,并发现两者同源性高达77%。CXCRl、CXCR2 主要与ELR⁺CXC趋化因子NAP-2、ENA-78、GRO等特异结合而发挥其生物学效应。

HBV作为一种外源性抗原,刺激机体产生相应的免疫反应以清除病毒,其中以特异性CTL介导的细胞免疫起着重要作用。活化的CTL细胞不仅可杀伤靶细胞,而且还能产生细胞因子,直接作用于肝细胞从而改变胞内基因的表达。大量研究证明,慢性乙肝患者肝脏炎症局部主要有Th1细胞和Th0细胞,无Th2细胞,天然T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、单核巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎症细胞的浸润,这与CXC趋化因子趋化吸引的靶细胞一致。而趋化因子通过与其相应的受体结合后,可趋化、激活中性粒细胞,T、B 淋巴细胞及单核细胞等各种炎症细胞向炎症部位聚集,其中 CXC亚族趋化因子主要在急性炎症反应中介导炎性细胞游走和趋化。而CC亚族趋化因子则主要参与慢性炎症过程中的单核细胞及淋巴细胞等的趋化和活化^〔15〕。因此,慢性乙肝患者可通过高表达相应的CXC趋化因子水平,诱导、激活表达相应受体的炎症细胞向肝脏组织定向迁移,在感染局部发挥着辅助病毒特异性的CTL及活化其他免疫细胞发挥作用,同时还可活化细胞分泌更多的趋化因子,进一步介导淋巴细胞等炎症细胞在肝脏内聚集,从而参与肝脏炎性反应^{〔16, 17, 18, 19, 20, 21〕}。 HBV感染宿主细胞后可通过顺式或反式作用影响宿主细胞中趋化因子及其受体的表达,趋化因子及其受体的异常表达可通过多种途径影响宿主细胞的生物学行为和机体对感染病毒的特异性及其非特异性免疫应答,从而改变疾病的转归,同时病毒本身可编码某些趋化因子或趋化因子受体样分子,干扰趋化因子及其受体的网路功能。ELR⁺CXC趋化因子主要有IL-8、ENA-78、GCP-2、GROα、β、γ、等。其中IL-8最为常见。IL-8是宿生对损伤和炎症应答的重要介质.由多种免疫细胞如单核-巨噬细胞、T淋巴细胞及中性粒细胞以及HBV 感染的肝细胞等分泌。

多数资料认为,血清IL-8在慢性乙肝患者血清中增高可能的原因有:(1) H BV感染可诱使肝细胞产生IL-8的能力增强。但不同病因引起的肝脏疾病中存在极大差别,同一肝脏疾病不同阶段也有明显差异。(2)慢性肝脏疾病时,肝脏机能不良导致对IL-8的清除能力减弱。(3)慢性肝脏疾病时,细胞因子、内毒素,甚至局部组织缺氧均可诱生IL-8。

慢性乙肝患者肝脏局部组织常伴有单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等炎症细胞的浸润。CXCR1、CXCR2是表达在中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞表面的G蛋白偶联受体,与其相应的配体结合后可趋化表达该受体的中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞的游走,因此,CXCR1、CXCR2在局部肝组织的炎症反应中起重要作用。2002年,Ajuebor等^〔22〕报道,抑制CXCR2可加重肝脏出血和坏死的程度,外源性注射CXCR2 的配体(IL-8/M IP-2/ENA-78)发现其可以引起肝脏的再生以减轻肝脏损伤。2009年,Krohn等^〔23〕对长达3周的大鼠肝细胞移植系统进行研究,采用RT-PCR法检测84种细胞因子和趋化因子基因的表达水平,并通过免疫组化法对表达上调基因进行确定,发现在同源肝细胞植入后的6 h内,有25 种细胞因子和趋化因子基因表达增加2~123倍,其中包括 CXCL1、CXCL2、CXCR1、CXCR2等,且证实这种基因表达上调与中性粒细胞和Kuffer细胞的活化有关。

ELR⁺CXC趋化因子可由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞及 HBV感染的肝细胞等分泌,主要趋化中性粒细胞、调节新生血管生成,引起部分肝细胞损伤,介导局部炎症细胞浸润。慢性乙肝是一种由HBV介导,以局部单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎症细胞浸润为主的感染性疾病。局部肝窦内皮细胞能产生IL-8、ENA-78等趋化因子,募集更多炎性细胞介导局部炎症反应,无明显的抗病毒作用,使局部炎症呈现慢性化表现。阻断其受体如CXCR1、CXCR2等表达可有效抑制相应趋化因子介导的局部炎症反应.减轻或延缓乙肝慢性化进程,可能成为今后抗炎治疗的优选靶位。