目前临床常规生化检测方法为湿化学法和干化学法。湿化学法是在反应容器中液态试剂和样品混合后发生化学反应,根据显色反应的颜色深浅,测定吸光度,根据Lambert-Beer定律计算待测物的浓度。干化学法又称固相化学法,是将一项测定中所需的全部或部分试剂固定在载体中,干化学法检测根据Kubelka-Munk理论,其反射率(R)与固相层的厚度(X)、单位厚度的光吸收系数(K)及固相反应层的散射系数S有关,当X和S固定时,R仅与K有关,而K的大小同待测物的浓度成正比,通过测定反射率的大小,可计算出待测物的浓度。由于2种方法的检测原理不同,导致一些项目检测结果出现差异,为临床患者疾病的诊断、治疗带来不便,本研究针对常规生化项目血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及总蛋白(TP)探讨2种方法检测结果的可比性,旨在分析生化检测结果的准确性和一致性。

2010年中国医科大学附属第一医院检验科门诊及住院患者生化检测标本。

(1)湿化学法试剂:生化校准品cfas (德国罗氏公司),朗道人血清水平2,水平3质控品(英国朗道公司),ALT及TP生化试剂(日本积水医疗株式会社)。仪器: 日立(HITACHI)7600全自动化分析仪(日本日立公司)。 (2)干化学法试剂:强生(VITROS)950全自动干片分析仪配套质控品及试剂(美国强生公司)。仪器:VITROS950全自动干片分析仪(美国强生公司)。

(1)连续10日,每日选择8份门诊及住院患者当日新鲜血清,共80份,血清无溶血、乳糜、黄疸等。 (2)按照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS) EP9-A 文件^〔1〕提供的方法比对实验数据分布建议表的要求选择样本浓度范围、浓度分配比例及例数。

HITACHI 7600生化分析仪参加卫生部室间质评成绩合格,室内质控日间标准差均< 1/3CLIA′88允许误差,且已通过ISO15189实验室认可,选用HITACHI 7600生化分析仪为参考方法,用VITROS 950实验方法进行方法间的比对实验。检测项目为ALT和TP,实验前对仪器进行常规维护与保养,2仪器均按常规方法进行校准和质控^〔2〕。每个项目的检测严格按厂商试剂盒的说明书进行。

(1)不采用已明确有人为误差的结果。(2)按EP9-A文件进行方法间离群值检查^〔1〕;(3)参考方法(X轴)测定范围的检验:实验方法数据的分布范围是否合适,用相关系数(r)粗略估计,如r≥0.975或r²≥0195,则认为数据范围合适,直线回归统计的斜率和截距是可靠的; 如r< 0.975,则说明数据范围不合适。(4)计算线性回归方程:Y=bX+a。(5)计算方法间的系统误差:根据临床使用要求,将各个项目给定的医学决定水平浓度X c代入回归方程,计算实验方法(Y轴)与参考方法(X轴)之间的系统误差 (SE),再根据总误差准则计算总误差,即系统误差加上随机误差(TE=SE+RE)。

以CLIA′88的允许误差为判断依据,用方法学比较评估的系统误差(SE)≤于允许误差的 1/2属临床可接受水平,总误差(TE)≤可允许的最大总误差属临床可接受水平,即不同检测方法间的测定结果具有可比性。

ALT分析的医学决定水平为50 U/L,总误差目标是医学决定水平的20%,即总误差为10 U/L。ALT的精密度目标定为1/4 CLIA′88总误差水平为2.5 U/L。TP分析的医学决定水平为70 g/L,总误差目标是医学决定水平的10%,即总误差为7 g/L。TP的精密度目标定为1/4 CLIA′88总误差水平为1.8 g/L。

表 1

表 1 质控物批内精密度( x±s)

表 1 质控物批内精密度( x±s)

干湿化学法分别对质控物检测 20次执行批内重复性试验,比较各自的平均值及标准差。

表 2

表 2 质控物日间精密度( x±s)

表 2 质控物日间精密度( x±s)

每天分析质控血清共20 d,比较各自的平均值、标准差。

实验样品数为80,统计分析得回归方程y=1.11x+6.62,Sy/x=7.31,r=0.998。 回归分析给出如下统计数据:斜率=1.11,显示出的比例误差为11%;y截距=6.62 U/L,标准误(Sy/x)=7.31 U/L,r= 0.998。y截距表明有6.62 U/L大小的固定系统误差。r> 0.975,证明研究的浓度范围有效。医学决定水平的系统误差为:医学决定性水平50 U/L的系统误差为12.12 U/L,y_C= 1.11×50+6.62=62.12 U/L,>允许的1/2总误差5 U/L,比较方法间不可接受。应用总误差准则,RE的估计值为4倍的日间标准差,在50 U/L的总误差为21.2 U/L,与可允许的总误差10 U/L相比较也不可接受。

实验样品数为80,统计分析得回归方程y=1.07x-4.8,Sy/x=1.41,r=0.996。回归分析给出如下统计数据:斜率=1.07,y截距=4.8 g/L,标准误 (Sy/x)=1.41 g/L,r=0.996。y截距表明有4.8 g/L大小的固定系统误差。r> 0.975,证明研究的浓度范围是有效的。医学决定水平的系统误差为:医学决定性水平70 g/L的系统误差为0.1 g/L,y_ac=1.07×70-4.8=70.1 g/L,小于允许的1/2总误差3.5 g/L,比较方法间是可接受的。应用总误差准则,RE 的估计值为4倍的日间标准差,在70 g/L的总误差为6.62 g/ L,与可允许的总误差7 g/L相比较也是可接受的。

本研究利用干化学法与湿化学法测定患者样本ALT、 TP,并以线性回归方程及1/2CLIA′88作为临床可接受性判定依据对实验结果进行对比,具有较大的可操作性和可行性,可以作为判断临床可接受性的一种参考方法。经分析,TP的检测结果具有对比性,由于干湿化学法检测TP具有良好的线性范围,分析偏倚较小,通过校正因数使两者具有可比性,可以使用同一正常参考值范围,并定期进行实验室对比实验,保证检测结果的一致性和准确性^〔3〕。对于ALT的检测结果进行对比,经统计学分析,ALT的检测结果不具有可比性,可能是由于2种不同检测方法的系统误差造成的,也可能是由于血清基质效应造成的^〔4〕。这可能与干化学和湿化学分析原理不同有关,干化学测定是按浓度-反射光度关系,非线性转换成线性关系,而湿化学中遵循Lambert-Beer定律,即浓度- 透光度的关系,呈线性关系,临床应用中应该各自建立独立的正常参考值,不能采用单一改变校正因数或系数来矫正干、湿化学的分析偏倚^〔5〕。

经过此次按EP9-A文件对2种分析方法的ALT和TP 项目进行评估,对这些项目在2分析方法间的偏倚有了明确的了解和准确的评价管理依据^〔6〕。对不可接受偏倚的项目采取了相应的纠正措施,保证了同一实验室检测结果的准确、 可靠,满足了临床的要求,使医学检验在临床疾病的诊断、治疗中发挥更好的作用。