德国组织学家Enricol Sertol认为支持细胞与生精过程有关^〔1〕。支持细胞波形蛋白(vimentin,VM)是支持细胞骨架的重要组成部分,He等^〔2〕报道任何影响VM结构与功能的因素均可干扰生精功能,甚至导致男性不育^〔3〕。随着现代化工业的发展,锰的生产和消费日益增多,特别是甲基环戊二烯羰基锰(MMT)作为汽油抗爆剂的广泛使用,导致环境中锰含量增多。过量锰对生精功能有损害作用^{〔4, 5〕},但其确切作用机制尚不清楚,本实验通过对染锰大鼠支持细胞波形蛋白表达与精子数量关系研究,为探讨锰对生精功能损害作用机制提供依据。

MnCl₂ 4H₂O (中国医药集团上海化学试剂公司)分析纯。VM单克隆抗体和即用型免疫组织化学链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)(鼠)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

健康雄性清洁级SD大鼠(第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心)48只,体重(120±10) g,许可证号:SCXK-(军)20020008,饲养温度18~25 e,湿度50%~65%。将大鼠随机分为30,15 mg/kg染锰组和空白对照组(生理盐水),染锰4,6周各3组,共6组,每组8只。 腹腔注射染锰,1次/d,5 d/周,分别连续染锰4周和6周。实验末处死大鼠,立即分离睾丸和附睾,生理盐水冲洗,附睾用于精子计数,将左侧睾丸分成4份,速置于10%中性甲醛溶液内固定备用。

睾丸称重后按照公式计算睾丸脏器系数:睾丸脏器系数=睾丸重(g)/大鼠体重(g)× 100%。取左侧附睾将其置于1mL生理盐水中,剪碎,制成精子悬液置于60 ℃水浴中,处死精子。按红细胞计数法,计数 5个中方格内精子数,记为R,然后按公式:R×50 000,计算精子数量(10⁷/mL)。

常规方法脱水,石蜡包埋。取方位相同一份标本连续切片4张,厚4 μm。按试剂盒说明检测支持细胞VM表达。VM免疫阳性产物位于睾丸支持细胞细胞质,呈棕黄色或棕褐色。在每张切片标本近长轴上,从左至右连续观察10个生精小管横切面,计数支持细胞VM表达阳性支持细胞数和总支持细胞数,计算出百分比值,即为支持细胞VM阳性细胞率。

采用SPSS 13.0统计软件行单因素方差分析,描述两变量之间的关系采用直线相关分析,检验水准α= 0.05,P < 0.05表示差异有统计学意义。

表 1

表 1 染锰对大鼠睾丸脏器系数和精子数量影响(n= 8,x±s)

表 1 染锰对大鼠睾丸脏器系数和精子数量影响(n= 8,x±s)

与空白对照组比较,染锰15,30 mg/kg 4周组睾丸脏器系数明显降低(P < 0.01)。各染锰组精子数量均明显降低(P < 0.01);染锰时间相同,30 mg/kg组与15 mg/kg组比较,精子数量明显减少(P < 0.01);染锰剂量相同,染锰6周与染锰4周比较,精子数量减少(P < 0.01)。

表 2

表 2 锰对大鼠支持细胞VM 阳性细胞率的影响( n= 8,x±s)

表 2 锰对大鼠支持细胞VM 阳性细胞率的影响( n= 8,x±s)

与空白对照组比较,各染锰组VM阳性细胞率均明显降低(P < 0.01)。染锰时间相同,30 mg/kg MnCl₂组与15mg/kg MnCl₂ 组比较,VM阳性细胞率明显降低(P < 0.01)。染锰剂量相同,染锰6周组与染锰4周组比较,VM阳性细胞率明显降低 (P < 0.01),具有一定时间-效应与剂量-效应关系。

各组大鼠精子数量与支持细胞VM表达呈正相关关系,相关系数r=0.895,P < 0.01。

生精上皮是特殊的复层上皮,其内无血管,生精细胞的营养必须通过支持细胞提供。支持细胞结构与功能损伤,直接影响生精细胞的生长发育和分裂分化及精子形成。支持细胞质内有丰富的VM,VM围绕细胞核分布,其C端结合在细胞核外膜上并呈束网状向支持细胞边缘延伸,另一端与细胞膜上粘附生精细胞的粘着斑连接^〔6〕。VM是支持细胞质骨架的主要成分并参与血-睾屏障的形成,在维持支持细胞的正常形态结构及稳定生精内环境中起决定性作用^〔7〕,此外还参与支持细胞与生精细胞间的信息、物质交流与细胞凋亡^{〔8, 9〕}。 本实验结果显示,染锰15 mg/kg 4周,支持细胞vimentin阳性细胞率开始低于对照组,且随染锰剂量的增加和时间的延长而降低,具有一定的时间和剂量效应关系,其表达与精子数量成正相关;表明过量锰可以抑制支持细胞vimentin表达,从而破坏支持细胞骨架及血睾屏障的结构与功能,促使VM失去正常的收缩作用并且干扰生精微环境,阻碍生精细胞向管腔移动和精子释放,从而诱发生精细胞凋亡增加,精子数量减少,导致生精障碍,这可能是生精细胞凋亡与生精障碍的主要分子机制之一。