苯并[a]芘(B[a]P)及其衍生物是国际公认的化学诱变剂和人类致癌物^〔1〕。但近几年国内外研究发现,苯并[a]芘除具有致癌性外,还有一定神经毒性,苯并[a]芘可以透过血脑屏障进入大鼠脑组织,还能通过嗅神经直接进入大脑^〔2〕。 苯并芘及其代谢产物在脑内的具体分布研究较少。本研究于 2009年以SD大鼠为研究对象,用光镜放射自显影法观察¹⁴C 标记B[a]P及其代谢产物在大鼠脑组织中动态分布,为防治 B[a]P神经毒性提供理论依据。

¹⁴C -B[a]P (美国Sigma公司),Em-1核乳胶(英国Amersham公司),D-19 b显影液和F-5定影液(上海感光材料厂),COBRA-型自动r计数仪(美国CANBRA公司);C-5050光学显微镜和BX 41数码相机(日本OLYMPUS 公司);Cm 1900冰冻切片机(西德徕卡公司);乳胶涂布箱 (北京医科大学电子仪器厂)。

健康21 d雄性SD大鼠100只(重庆医科大学动物中心),体重40~50 g,活动能力相近,随机分为对照组和实验组,每组各50只,将¹⁴C -B[a]P用丙酮稀释到 7.4×10⁵ Bq/mL,从尾静脉注射给药,实验组按[¹⁴C]苯并[a] 芘3.7×10⁵ Bq/kg注射,对照组注射相同剂量生理盐水。

染毒后1,6,12,24,48 h,分别取实验组和对照组大鼠10只,乙醚麻醉行全身灌流固定,迅速取脑称重,将称重后脑组织置于-25 ℃冰冻切片机内冷冻 30 min。冠状切片,片厚5 μm,4%多聚甲醛固定10min,冷风吹干后在标本上涂一层核乳胶,将载玻片放人标本盒内,外包黑纸,置-80 ℃冰箱曝光24 h,曝光结束后显影、定影、苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察[¹⁴C]苯并[a]芘银粒(显色与背景反差较大,大小较统一的颗粒)在脑组织分布情况。 银粒位置代表核素点源的真实位置。

用SPSS 13.0软件分析,多样本均数比较采用单因素方差分析,两两比较用q检验;两样本均数比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

实验组在B[a]P 注射后1 h即有银粒出现,随着时间增加,银粒逐渐增加,24 h 达高峰,48 h明显减少。1,6,12,24,48 h银粒数分别为 (17.68±1.79),(22.67±2.15),(25.79±2.55),(32.33± 2.78),(18.01±1.68)粒,差异有统计学意义(F=69.67,P < 0.01)。对照组脑组织未见银粒。

表 1

表 1 14C-苯并[a]芘在不同脑区的分布(粒, x±s, n= 10)

表 1 14C-苯并[a]芘在不同脑区的分布(粒, x±s, n= 10)

随时间变化,银粒在各脑区的分布情况不同,注射后.h海马内银粒数最多,高于大脑皮质、纹状体和下丘脑,差异有统计学意义(F=80.45,P < 0.01);注射后6 h大脑皮质银粒数增加,高于海马、纹状体及下丘脑,差异有统计学意义(F=12.86,P < 0.01);注射后24 h银粒主要集中在纹状体,明显高于其他脑区,差异有统计学意义(F=50.18,P < 0.01)。

表 2

表 2 14C-苯并[a]芘在神经元和神经胶质细胞分布( 粒, x±s, n= 10)

表 2 14C-苯并[a]芘在神经元和神经胶质细胞分布( 粒, x±s, n= 10)

注射后1~48 h银粒在脑组织神经元和神经胶质细胞中均有分布,且在各个时相点神经元中的银粒数均明显高于神经胶质细胞,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

本研究结果表明,注射¹⁴C-B[a]P后1 h大鼠脑组织内出现B[a]P银粒,随时间延长,银粒数逐渐增加,并于24 h达到高峰,48 h时明显减少,表明苯并[a]芘及其代谢物透过血脑屏障进入动物神经组织后,1~24 h消除速度小于吸收速度,通过血液或其他途径转移到脑组织的B[a]P增多,脑内含量增加,24~48 h消除速度大于吸收速度,B[a]P大量排出,脑内含量明显减少。银粒在各个脑区的分布不均匀,注药后1 h 银粒主要分布在海马,6 h分布在大脑皮质,24 h集中分布在纹状体。

本研究发现,注射¹⁴C-B[a]P后1~48 h脑神经元细胞和神经胶质细胞内均有银粒分布,而且神经元中银粒数明显高于神经胶质细胞。进入脑组织中的B[a]P可为神经元表面的芳香烃受体(AhR)所识别,形成AhR配体复合物,这种复合物易位到细胞核和配偶体共活化物形成异二聚体,再绑定到反应的识别序列上,导致细胞色素P 450 A 1等下游基因的变化产生致突变的代谢产物和激活活性氧^〔3〕,使得神经元活化异常,甚至程序性死亡^〔4〕。推测[¹⁴C]-B[a]P靶部位可能是神经元细胞。