中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (10): 1265-1267   PDF    
引用本文
潘妹霞, 李卓能, 肖本熙, Victor Yeung, Ruo-Jun Xu. 大豆异黄酮对去势大鼠学习记忆能力改善作用[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(10): 1265-1267.
PAN Mei-xia, LI Zhuo-neng XIAO Ben-xi, et al. Soy germ phytoestrogens improve spatial memory performance in ovariectomized rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(10): 1265-1267.
大豆异黄酮对去势大鼠学习记忆能力改善作用
潘妹霞1, 李卓能2, 肖本熙1, Victor Yeung3, Ruo-Jun Xu3    
1. 广东省人民医院(广东省医学科学院)营养科, 广州 510080;
2. 武汉市疾病控制中心;
3. 香港大学生命科学院
收稿日期: 2010-05-17.
作者简介: 潘妹霞(1972- ),女,海南万宁人,主治医师,博士,主要从事临床营养工作.
摘要: 目的 探讨雌激素和大豆异黄酮对去势大鼠空间学习记忆能力的影响及其可能作用机制。方法 将28只去势SD大鼠随机分为4组,分别给予基础膳食,基础膳食中添加低、高剂量异黄酮(0.4,1.6 g/kg)和雌激素(0.15 g/kg);12周后,以水迷宫法检测大鼠空间学习记忆能力,并检测海马区脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BD-NF)和酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptors B,TrkB)的表达。结果 低、高剂量异黄酮组和雌激素组大鼠的平均逃避潜伏期分别为(21.20±4.41),(19.61±4.90),(10.51±1.92)s,游泳总路程分别为(3.62±0.69),(3.76±0.60),(2.43±0.57)m,明显低于对照组的(37.77±8.25)s和(5.87±1.05)m;雌激素和高剂量大豆异黄酮明显提高海马区BDNF水平及其受体TrkB的mRNA表达;未发现异黄酮对大鼠子宫和阴道内膜的雌激素样作用。结论 大豆异黄酮可改善去势大鼠的空间学习记忆能力,其作用可能与大鼠海马区BDNF及其受体表达有关。
关键词: 大豆异黄酮     雌激素     学习记忆     脑源性神经营养因子(BDNF)    
Soy germ phytoestrogens improve spatial memory performance in ovariectomized rats
PAN Mei-xia, LI Zhuo-neng, XIAO Ben-xi, et al    
Department of Nutrition, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital Guangzhou 510080, China.
Abstract: Objective To determine the effects of estradiol and soy germ phytoestro gens on spatial learning and memory performance in ovariectom ized rats and to explore the possible mechanisms.Methods Ovariectomized Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups and assigned one of the following diets:basic diet,basic diet supplemented with phytoe strogens(0.4,1.6 g/kg diet) or 17B-estradiol(0.15 g/kg diet) for 12 weeks.The rats were evaluated for their spatial learning and memory performance with Morris water mazetask.The brain-derived neurotrophic factor(BDNF) and its tyro sine kinase receptors B(TrkB) receptor expression were measured.Results The rats supplemented with phytoestrogens and estradiol performed significantly better in spatial memory acquisition and retention compared to the controls.Escape latency (s)in rats supplemented with low-phytoe strogens(21.20±4.41),high-phytoe strogens(19.61±4.90) or estradiol(10.51±1.92) was significantly lower than that of the control(37.77±8.25).Trip distance(m) in rats supplemented with low phytoe strogens(3.62±0.69),high-phytoe strogens(3.76±0.60) or estradiol(2.43±0.57) was significantly shorter than that of the control(5.87±1.05).Estradiol or the high dose of phytoe strogens treamtent significantly increased the BDNF expression and mRNA level for TrkB recep to rs1Phy toestro gens did not showany significante strogenic-effect on the vaginal and uteri.Conclusion Phytoe strogens improve spatial memory performance inovariectomized rats.The memory enhance ment effect mayre late to the increased expression of BDNF and its TrkB receptor in the hippocampus.
Key words: phytoe strogens     estradiol     learning and memory     brain-derived neurotrophic factor(BDNF)    

雌激素可提高去势沙鼠〔1〕和围绝经期妇女的认知能力〔2〕。但是,雌激素的补充可增加绝经期妇女生殖系统的肿瘤发生率,包括子宫、卵巢和乳腺肿瘤〔3〕。有报道,植物雌激素(如大豆异黄酮)可改善去势老年大鼠的工作记忆能力〔4〕,但是其作用机制未明。脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其受体酪氨酸激酶B (tyrosinek-inasereceptors B,TrkB)分布在大脑的海马组织,对记忆的获得和保留具有关键的调节作用〔5〕。本研究观察大豆异黄酮对去势大鼠空间学习记忆能力的影响,以及海马区BDNF及其受体TrkB 的表达,分析BDNF及其受体表达对学习记忆力改善作用。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

氯胺酮/赛拉嗪(美国Sigma公司),大豆异黄酮(荷兰Acatris公司),含异黄酮糖苷267mg/g,蛋白酶抑制剂(美国Calbiochem公司),双夹心抗体BDNF检测ELISA 试剂盒(美国Promega公司),AllPrepTM DNA/RNA/Protein提取试剂盒(美国Qiagen公司),冲击研磨棒(美国Sigma-Aldrich 公司),SuperScriptTM Ⅲ First-strand Synthesis SuperMix、SYBRR Safe DNA荧光染剂(美国Invitrogen公司),Morris水迷宫系统 (美国Noldus公司),梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司),BX-50 型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 动物分组与处理

本动物研究通过香港大学动物伦理委员会批准(1072-05)。清洁级,3月龄健康SD大鼠(香港大学实验动物中心)28只,体重(330.83±11.48) g,腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉,手术摘除双侧卵巢。术后18 d,将动物按体重随机分为4组(n=7):对照组(基础饲料)、雌激素组 (17β-雌二醇0.15 g/kg)、低、高剂量异黄酮组(大豆异黄酮 0.4,1.6 g/kg)。基础饲料按AIN-93G (美国Harlan Teklad公司)配方配制,分别以酪蛋白和玉米油替代饲料中大豆蛋白和大豆油。饲养12周。饲养条件:温度20~23 ℃,湿度 50%~55%,12h/12h昼夜周期。动物自由摄食进水,每周记录动物体重和摄食量。进行行为学测试后,大鼠处死,迅速冰上分离大脑海马组织,按照Szapacs 〔6〕的方法制备20%组织匀浆,保存于-80 ℃备用。

1.3 观察指标及检测方法 1.3.1 Morris水迷宫法检测学习记忆能力

将水池等分为4 个象限,于第1象限(目标象限)中心置100 cm2隐蔽平台。 定位航行试验:训练5 d,每天分别从3个不同入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录2 min内找到平台所需要时间(即逃避潜伏期)及活动总路程。空间探索试验:撤除平台,将大鼠由第3象限放入水中,记录2 min内跨越原平台位置次数、在原平台所处象限中所用相对时间和路程。

1.3.2 阴道涂片与苏木素-伊红(HE)染色观察

大鼠饲养到第11周时,连续10 d以0.2 mL 0.9%生理盐水进行阴道涂片,显微镜下观察涂片的细胞学特征。分离大鼠子宫,称重后置于10%福尔马林中固定48 h,取右侧子宫石蜡包埋,切片,HE染色后进行组织学分析。

1.3.3 海马组织BDNF、TrkBmRNA测定

采用ELISA法分别检测海马组织总BDNF和成熟型BDNF含量。用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测海马组织BDNF (NM 012513) 和TrkB (NM 012731)的基因表达水平。引物序列分别为磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)顺式GGGTGTGAACCACGAGAAAT,GAPDH反式GGAAGAATGGGAGTTGCTGT,BDNF顺式TGTGACAGTATTAGCGAGTGGGT,BDNF反式CGATTGGGTAGTTCGGCATT,TrkB顺式CTTATGCTTGCTGGTCTTGG,TrkB反式 GGGTATTCTTGCTGCTCTCA。

1.4 统计分析

采用SPSS 15.0软件进行单因素方差分析,组间比较采用Student-Newman-Keds (SNK)法,P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 一般情况

喂养期间4组动物的活动量明显不同,雌激素组大鼠活动量最为活跃,其次分别为高剂量异黄酮组,低剂量异黄酮组和对照组。喂养12周后,各组动物体重增重分别为对照组(96.28±13.63) g,低、高剂量异黄酮组(89.15± 11.9)和(48.67±14.13) g,雌激素组(2.10±11.38) g。

2.2 各组大鼠子宫和阴道改变

雌激素组大鼠子宫湿重为 (0.56±0.04) g,明显高于对照组(0.10±0.01) g (P < 0.05)。 低、高剂量异黄酮组大鼠子宫湿重与对照组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。对照组和低剂量异黄酮组大鼠连续10d 阴道涂片未见动情周期表象,阴道涂片以白细胞为主以及少量不规则角化上皮细胞。而雌激素组阴道涂片主要为较大、 不规则非角化上皮细胞。HE染色显示对照组和低剂量异黄酮组子宫内膜萎缩,上皮细胞未见分裂迹象。雌激素组子宫内膜上皮细胞分裂相明显。

2.3 学习记忆能力行为学检测(表 1)
表 1 各组大鼠定位航行以及空间探索试验结果(…x±s, n= 7)

定位航行试验结果显示,高剂量异黄酮组和雌激素组大鼠在训练期第2~5 d逃避潜伏期明显低于对照组(P < 0.05)。雌激素组、低、高剂量异黄酮组大鼠训练第5 d总路程明显低于对照组(P < 0.05)。 空间探索试验空间探索试验的结果显示,大鼠在第1象限 (目标象限)停留时间随着异黄酮和雌激素饲喂有升高趋势。

2.4 大脑海马BDNF和TrkB的表达(表 2)
表 2 海马组织BDNF蛋白水平及BDNF和TrkB mRNA 表达量(……x±s, n= 7)

海马组织中大约20%~22%的BDNF是成熟型BDNF。高剂量异黄酮和雌激素组的总BDNF和成熟型BDNF明显高于对照组(P < 0.05)。高剂量异黄酮和雌激素组海马组织的BDNF mRNA 与TrkB mRNA表达水平明显高于对照组(P < 0.05)。

3 讨 论

Morris水迷宫定位航行实验反映动物获取空间信息和学习的能力;而空间探索实验反映其记忆贮存能力及提取再现能力。本研究结果表明,大豆异黄酮可以提高去势雌性大鼠的空间学习和记忆能力。有研究显示,雌激素和大豆异黄酮可提高海马BDNF mRNA水平〔4〕。BDNF属于神经营养因子家族成员,对神经元的活性、分化、表型起关键作用〔7〕。后突触的BDNF-TrkB途径对于调节兴奋性突触传递和长时程增强效应(LTP)尤为重要,而LPT是记忆形成的重要突触连接〔8〕。BDNF合成初期以前体形式存在,裂解为成熟型BDNF,可激活Trk受体,提高神经元活性和突触可塑性;而前体 BDNF可激活p75受体发挥与成熟型BDNF完全相反的作用,因此,神经营养因子的存在形式决定它们对神经组织的作用〔9〕。本研究结果表明,大豆异黄酮和雌激素均可提高海马 BDNF的表达,包括成熟型BDNF表达,提示它们对去势大鼠学习记忆能力的改善与海马BDNF表达有关。本研究未发现补充大豆异黄酮对阴道和子宫内膜的雌激素样作用,证实了大豆异黄酮对生殖系统的安全性〔10, 11〕。

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