铜绿假单胞菌广泛存在于自然界,是导致临床感染最常见的病原菌之一,可引起医院感染流行和暴发^〔1〕。该菌耐药性强,耐药谱广,对多种抗生素表现为天然或获得性耐药。碳青霉烯类抗生素常被作为治疗铜绿假单胞菌感染的最后一道防线。近年来,随着碳青霉烯类药物的广泛应用,铜绿假单胞菌对其耐药性日趋增强,并呈多重耐药,给临床治疗带来困难。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制复杂,且不同地区及不同碳青霉烯类药物种类的耐药机制也存在较大差异^{〔2, 3〕}。为了解临床分离铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药特点和机制,选取2006年6月-2008年6月温州医学院附属第一医院临床分离的162株铜绿假单胞菌,进行外膜蛋白基因OprD₂、碳青霉烯酶基因VIM、IMP、SPM、KPC检测和膜外排机制研究。现将结果报告如下。

(1)铜绿假单胞菌:162株,均为2006年6 月-2008年6月温州医学院附属第一医院临床各类标本分离株(剔除同一患者同一部位重复分离菌株),其中痰液标本 112株,脓液21株,尿液14株,血液8株,其他标本7株,均经 VITEK-60自动化分析系统鉴定确认。(2)质控菌株:铜绿假单胞菌ATCC27853(卫生部临床检验中心);IMP、VIM、KPC 基因阳性对照菌株(浙江大学附属邵逸夫医院俞云松教授惠赠);OprD₂野生株为本科室保存菌株。

VITEK60型全自动细菌分析仪(法国梅里埃公司),Eppendorf 5332型PCR扩增仪(德国Eppendorf 公司),水解酪蛋白胨(M-H)琼脂(英国Oxoid公司);羰基氰氯苯腙(CCCP,美国S igm a公司);亚胺培南、美罗培南标准品(中国药品生物制品检定所)。

按美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的琼脂稀释法测定2种抗生素的最低抑菌浓度,细菌接种量为104CFU/点,35 ℃培养18~20 h后观察结果,按CLSI规定标准进行判定,MIC≤4 mg/L为敏感 (S),MIC=8 mg/L为中介(I),MIC≥16 mg/L为耐药(R)。

采用聚合酶链式反应(PCR)技术,进行OprD₂,VIM、IMP、SPM、KPC等耐药基因检测,根据Genbank 中已经报道的序列合成引物,按常规方法建立PCR体系。(1)引物及预期产物大小:① OprD₂:P1 5′-GCGCATCTCCAAGACCATG-3′,P2 5′-GCCACGCGATTTGACGGAG-3′,扩增片段长度193 bp;② VIM:P1 5′-CAGATTGCCGATGGTGTT-3′,P2 5′-GCAGCACCAGGATAGAAGAG-3′,扩增片段长度39.bp;③ IMP:P1 5′-GCAGTCGCCCTAAACAAAG-3′,P2 5′-CGCCTTGTTGTTAGAAATTTAGTT -3′,扩增片段长度792 bp;④ SPM-1:P1 5′-CCTACAATCTAACGGCGACC-3′,P2 5′-TCGCCGTGTCCAGGTATAAC-3′,扩增片段长度650 bp;⑤ KPC:P1 5′-TGTCACTGTATCGCCGTC-3′,P2 5′-CTCAGTGCTCTACAGAAAACC -3′,扩增片段长度1 080 bp。(2) PCR产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下观察结果,出现与阳性对照菌株扩增产物DNA分子量相当的条带判为阳性;OprD₂ 基因出现扩增产物者为野生株,不出现扩增产物者提示OprD₂ 基因缺失。碳青霉烯酶基因阳性株的PCR扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序,序列经BLAST比对分析。

与亚胺培南、美罗培南MIC检测同时进行。在分别含2种抗生素的M-H琼脂平板中加入 CCCP至终浓度为5 mg/L,测定CCCP存在情况下抗生素对铜绿假单胞菌的MIC值;同时接种到只含上述浓度CCCP的M-H 琼脂平板作为细菌生长对照。加入CCCP前后,同一菌株对抗生素MIC值降低≥4个稀释浓度时,判为外排表型阳性^〔4〕。

MIC检测结果表明,162株铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药60株,占37.0%;中介4株,占2.5%;敏感 98株,占60.5%。对美罗培南耐药50株,占30.9%;中介9 株,占5.6%;敏感103株,占63.5%。有50株同时对2种抗生素耐药,占30.9%。提示铜绿假单胞菌对2种抗生素均有较高的耐药率,差异无统计学意义(χ²=1.38,P > 0.05)。

图 1

注:1:野生株对照;3,5,6:OprD2 基因阳性分离株;2,4:OprD2 基因缺失分离株;7:阴性对照;M:为Marker。 图 1 OprD2 基因PCR 扩增产物电泳图

60株耐亚胺培南和/或美罗培南菌株(简称耐药株)中,共检出OprD₂基因缺失株18株,占30.0%,其中在50株同时耐2种抗生素的菌株中检出11株,占22.0%,在仅对亚胺培南耐药的10株中检出7株;102株不耐亚胺培南或美罗培南菌株(敏感株)中OprD₂基因缺失20株,占19.6%。耐药株与敏感株OprD₂基因缺失差异无统计学意义(χ²=2.27,P > 0.05)。

图 2

注:1,2,3: VIM 基因阳性分离株; 4:VIM 基因阳性对照菌株; 5:阴性对照; M:Marker。 图 2 VIM 基因PCR扩增产物电泳图

图 3

注: 1,2,3:IMP基因阳性分离株; 4:IMP基因阳性对 照菌株; 5:阴性对照; M: Marker 图 3 IMP基因PCR 扩增产物电泳图

耐药株中,共检出碳青霉烯酶基因阳性株13株,检出率为21.7% (13/60),其中VIM基因型5株,IMP基因型8株;敏感株中未检出VIM、IMP基因;所有分离株中均未检出SPM和KPC 基因型。

对碳青霉烯酶基因PCR阳性产物进行测序,并与GenBank中的已知序列比对,其中5株VIM基因阳性分离株与FJ624864比对,100%同源,均为VIM-2亚型;IMP 基因有7株与DQ842025比对,100%同源,为IMP-1亚型,.株与AB188812比对,99%同源,为IMP-6亚型。

表 1

表 1 162株铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗 培南外排试验阳性率比较

表 1 162株铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗 培南外排试验阳性率比较

162株铜绿假单胞菌分离株中,含亚胺培南平板培养基菌株检出外排表型试验阳性21株,阳性率为13.0%;含美罗培南平板培养基菌株检出29株,阳性率为17.90%。表 1可见,2种抗生素的耐药株主动外排表型阳性率均高于该抗生素的非耐药株,差异均有统计学意义(均P < 0.01)。

碳青霉烯类抗生素以其超广的抗菌谱和极强的抗菌活性成为治疗铜绿假单胞菌感染的重要药物,但随着其在临床的大量使用,耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌日益增加,本研究结果表明,162株铜绿假单胞菌分离株对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达37.0%和30.9%。

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制复杂13,5-62。研究认为,铜绿假单胞菌膜孔蛋白OprD₂是亚胺培南选择性进入菌体的特异性通道,OprD₂缺失或表达减低可选择性地导致亚胺培南耐药,而保留对其他抗生素的敏感性132。Giske等172研究显示,对亚胺培南敏感的铜绿假单胞菌中存在OprD₂蛋白量减少。本研究结果表明,OprD₂基因缺失在铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药中起一定作用;102 株敏感株有20株(19.6%)经PCR扩增未检测到OprD₂基因,造成这一现象的原因,是否与PCR检测的灵敏度、基因的表达量有关,或亚胺培南通过其他外膜蛋白进入细菌内,均有待进一步研究。

碳青霉烯酶是最重要的一群水解碳青霉烯类抗生素的 B-内酰胺酶^〔8〕,铜绿假单胞菌中以IMP和VIM基因型多见,但文献报道这2种基因在碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌中的检出率差异很大^{〔2, 5, 9〕}。本研究从耐药菌株中,检出VIM基因型5株,IMP型基因型8株,检出率为21.7%,与文献报道不完全一致^{〔2, 3, 5, 9〕}。

研究证实^{〔6, 7〕},外排泵的过度表达可导致药物在菌体内蓄积量降低,继而抗菌活性下降。外排泵抑制剂CCCP可导致转运蛋白失去能量供应,使药物在细菌体内的蓄积浓度增加,从而影响外排泵的活性。本研究结果也表明,主动外排泵对铜绿假单胞菌的碳青霉烯类抗生素的耐药性有普遍影响,是铜绿假单胞菌耐多药的重要原因之一,与文献报道^〔6〕铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的主要机制为主动外排系统的过度表达相符。

值得注意的是,在本研究中,60株亚胺培南和/或美罗培南菌耐药株中有11株菌(18.3%)既未发现外膜蛋白基因 OprD₂缺失,又未检测到VIM、IMP、SPM、KPC等耐药基因,也没有主动外排系统的过度表达,其耐药可能与抗生素结合位点改变、生物被膜形成^〔10〕、新的碳青霉烯酶存在等有关,其具体原因还有待进一步研究。