醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate,MPA)为孕激素类中的一种合成性激素。在兽药中,被用作催肥激素,以促进动物生长,提高饲料转化率,节省成本,提高经济效益^〔1〕。但是长期或大量食用含有甲羟孕酮激素的动物源性食品可扰乱人体内分泌、生长发育、免疫系统、生殖系统等方面的正常功能,甚至致癌、致畸。为防止醋酸甲羟孕酮进入食物链,需要一种快速、敏感的检测技术。本研究以人工合成的醋酸甲羟孕酮-卵清白蛋白(MPA-OVA)为包被抗原,抗醋酸甲羟孕酮单克隆抗体(LMG-McAb)为一抗,建立检测醋酸甲羟孕酮的间接竞争ELISA,为水产品中的醋酸甲羟孕酮残留检测提供一种简单、快速、高灵敏度和低成本方法。

醋酸甲孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮(美季生物试剂有限公司);牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA) (美国Sigma公司);羧甲基羟氨盐酸(CMO)(美国Orcanics公司);羟琥珀酰亚胺(NH S)、N,N′-二环己基碳二亚胺 (DCC)(国药集团化学试剂有限公司);HRP标记的羊抗鼠 IgG、四甲基联苯胺(TMB)(上海振羽生物科技有限公司)。

(1)合成MPA衍生物(MPS),产物的提取纯化参照文献〔2〕进行。(2) MPS与BSA偶联。(3) 完全抗原的鉴定(中国科学院上海生化细胞所)。

取BALB/C小鼠4只,用MPSBSA 偶联物作免疫原,免疫剂量与免疫程序按文献〔3〕进行。 无菌采取免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞以5B1混合,常规方法融合。细胞克隆、筛选及单抗制备按文献〔4〕方法进行,纯化后冻干保存。

(1)单抗工作浓度和包被抗原浓度确定:采用方阵滴定法。(2)间接竞争ELISA步骤: 取一定质量浓度的醋酸甲地孕酮-鸡卵清白蛋白偶联物 (MPA-OVA)包被酶标板,每孔加入样品提取液或MPA标准溶液50 μL和单抗50 μL,37 ℃孵育1.5 h,洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(HRP-IgG)100 μL (稀释液为3%胎牛血清010.mol/L pH 7.2磷酸盐-吐温缓冲液),反应37 ℃孵育1.5 h,洗涤,加入底物基质液,显色。用酶标仪在450 nm波长下读取每孔吸光度值(A)。

分别以200,100,50,12.5,3.125,0.8,0.2 ng/mL浓度的MPA标准物(50 μL)与纯化的MPA-McAb (100 μL)反应。以吸光率A/A₀(A为MPA抑制时吸光度值,A₀ 为无MPA抑制时吸光度值)为纵坐标,以标准品浓度对数值为横坐标,绘制醋酸甲孕酮标准曲线。

取5 g黄鳝肉粗粉碎样品(精确到 0.01 g)样品到50 mL管中,再加入20 mL乙酸乙酯,涡旋振荡5 min。室温下3 000 r/m in离心10 min。取上清液4 mL于 50 ℃氮气吹干。加入3 mL乙腈和3 mL正己烷溶解残渣,振荡1 m in,离心5 min,吸去上层正己烷及其中间层。将下层溶液加到预先用4 mL乙腈活化的(1 g/3 mL)中性氧化铝柱上,并用3 mL腈洗脱。收集全部过滤液和洗脱液,于50 ℃氮气流下吹干。用2 mL 40%乙腈水液溶解残渣,取100 μL进行测定。

(1)检出限:测定10个不同批次标准品,计算A值的平均值(€x)和标准差(S),在标准曲线上查出(€x-3S)对应的MPA质量浓度为该检测技术理论上的检测下限(LOD)。(2)精确度:以批内误差和批间误差表示。批内误差:每一标准样品浓度作4次重复,以批内变异系数表示批内误差。批间误差:在不同时间重复3次,以批间变异系数表示批间误差。

用梯度稀释的醋酸甲孕酮、甲孕酮、醋酸甲地孕酮、已烯雌酚、无色孔雀绿、呋喃西林、氯霉素、四环素物作为抑制物,分别作抑制曲线,根据拟合曲线计算各药物半数抑制浓度(IC₅₀),然后计算交叉反应率(CR%)=(MPA的 IC₅₀/其他抑制物的IC₅₀)×100%。

将MPA标准品添加到5 g黄鳝鱼肉中,使终浓度分别为50,10,2 μg/kg,每个浓度设3个重复样,测定回收率。

图 1

图 1 BSA (M /Z)质谱图

图 2

图 2 MPA-BSA (M /Z)质谱图

合成MPS质谱鉴定,分子量为460,确证为目标化合物MPA-3-(O-羧甲基)肟。合成MPA-BSA用蒸馏水透析后送上海生化细胞所,利用飞行质谱法进行分子量测定。BSA、MPS-BSA分子量分别为65 469.14,76 045.66,MPS与BSA偶联比为25.17。

共获得4株单抗细胞株,对其中1株克隆经多次传代、冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体仍然稳定。用间接ELISA法测定细胞培养上清和纯化单抗的效价,分别达到1:640和1:1.28×10⁶。

和包被抗原浓度同时稀释纯化的单抗和抗原包被物,选择吸光度(A)值为1.0左右的单抗和抗原包被物的稀释度作为工作浓度。结果显示,单抗最适工作浓度为1:40 000,抗原包被物的最适工作浓度为1 μg/mL (1:10 000)。

图 3

图 3 MPA 标准抑制曲线

图 3为优化条件下MPA标准曲线,MPA在012~200 μg/L范围内,(A/A₀)与MPA浓度的对数值呈线性关系,回归方程为y=-26.867x+65.049,R² =0.983 7,IC₅₀=3.630 ng/mL。检出限为0.133 ng/mL。

醋酸甲羟孕酮与甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮的交叉反应分别为0.26%,10.67%,与已烯雌酚、无色孔雀绿、 氯霉素、四环素、呋喃西林等其他水产品用药物无交叉反应。

批内变异系数为3.125%;批间变异系数为3.557%。将MPA加到5 g黄鳝肉中使终浓度分别为 50,10,2 μg/kg,进行回收率试验。所得结果分别为40.23,8.35,2.02 μg/kg;回收率为80.46%~101.00%。

醋酸甲羟孕酮(MPA)属于小分子物质,只有与载体蛋白结合后,才具有免疫原性。分子免疫学原理认为半抗原与载体蛋白质的连接应在分子的远端,以突出抗原决定簇,并尽量保持原分子结构的特征,以保证抗血清能有效地与目标化合物特异地结合^〔5〕。研究表明,一定长度的间隔臂引入可使半抗原突出于载体表面,使产生针对半抗原抗体的可能性增加^〔6〕。本研究采用突出MPA特定的分子结构:17位碳上的乙酸酯基团和酮基,选择分子式左下方的3位羰基处接入活性基团,具体采用羧甲基羟氨盐酸与MPA反应,从而引入1个4碳原子的连接臂及-COOH。这样比盐酸羟胺-琥珀酸酐法修饰MPA ^{〔7, 8〕}反应步骤少及产物易于纯化。

醋酸甲羟孕酮单抗特异性试验时,选用其结构相似物醋酸甲地孕酮和甲羟孕酮进行试验。结果交叉反应率分别为 10.67%和0.26%,表明乙酸基团较母环结构上c=c对醋酸甲羟孕酮抗体特异性影响大。睾酮、雌酮无乙酸基团,因而与醋酸甲羟孕酮单抗交叉反应率较低。本研究以纯化的MPA 单克隆抗体为基础,建立了MPA间接竞争ELISA检测方法,其主要参数符合现行检测需要,与已往MPA的ELISA检测方法相比较^{〔2, 8〕},IC₅₀ 和检出限明显降低,灵敏度较高,特异性较好。