食源性病毒(foodborne virus)及水源性病毒(waterborne virus)是指以食品及水源为载体,导致人类患病的病毒。诺如病毒(Norovirus,NoV)是重要的食源性及水源性病毒之一,常在医院、餐馆、学校、养老院、家庭等人群中引起急性胃肠炎暴发^〔1〕。该病毒主要传播途径为食用受污染的食品、水及生活接触。近年对食源性及水源性诺如病毒的研究取得一定进展,现综述如下。

诺如病毒是1972年美国学者Kapikian用免疫电镜方法在美国诺瓦克镇腹泻患者的粪便中首先发现,当时称诺瓦克病毒(Norwalk virus),2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准命名为诺如病毒(Norovirus,NoV)。诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发在欧洲、美国、日本、中国等均有较多报道,近年更在日本及英国引起大规模暴发流行。2006年底日本诺如病毒胃肠炎暴发流行,2个多月内累计感染诺如病毒致胃肠炎人数达303.9万人^〔2〕。2007年入冬至2008年元旦英国有大约200万人感染诺如病毒患胃肠炎^〔3〕。中国近年诺如病毒引起急性胃肠炎暴发的报道增多,尤其是北京、广东、广西、浙江、河北等地。李晖等^〔4〕对2003-2004年广东暴发的13起急性胃肠炎疫情进行检测,结果发现有8起由诺如病毒引起。可见,在一定的传播条件下,诺如病毒能引起人间大规模传播,对公众健康危害巨大。

诺如病毒主要通过粪口途径感染,常见的传播途径为食用被污染的食品及水、生活接触。人群感染暴发最初通常由食用被污染的食品及水引起,然后通过人间传播方式导致更多人感染。美国疾病预防控制中心资料显示,1996-2000年348起诺如病毒胃肠炎暴发原因为:通过食用被污染食品(包括牡蛎等贝类)占47%,人间传播占20%,通过饮用被污染的水占6%,原因不明占27%^〔5〕。日本2001-2005年共有163起诺如病毒胃肠炎暴发,由食品引起的平均发病率为58.3%,提示食品污染是引起诺如病毒胃肠炎暴发的主要原因^〔6〕。有资料显示,饮用被污染的水^〔7〕、直接生吃或煮食不完全的贝类^〔8〕、蔬菜水果^〔9〕,面包点心^〔10〕等均可引起诺如病毒胃肠炎暴发。有文献报道,因食品及水源污染引起的疫情暴发在中国多发生在医院、学校、监狱、福利院等人群聚集的地方,发病例数在有些单位可高达几百人^{〔11, 12〕}。除戴迎春等^〔13〕在一起家庭聚集性暴发的粪便标本及凉伴蟹肉均扩增出诺如病毒目的片段外,其他调查报道的暴发原因均为流行病学调查,缺乏实验室检测支持。在中国由于尚未建立统一有效的水及食品中的诺如病毒检测方法,难以在诺如病毒胃肠炎暴发后,对怀疑污染的食品及水进行实验室检测确认。

对污染食品及水中的诺如病毒准确检测,能为疫情暴发原因的确定提供有力的实验室依据。由于食品及水标本量大,病毒浓度低,须经病毒富集,并采用灵敏度较高的PCR作为主要检测方法,其中病毒富集是检测的关键。目前食品及水中病毒富集的方法主要有2种:(1)膜过滤法:主要原理是利用各种膜及病毒的电荷性,通过静电吸附作用达到富集效果,常用于水及液体的病毒富集;(2)有机絮凝沉淀法:常用于各类食品的病毒富集。其主要原理是先改变样品pH值,使毒粒与样品微粒分开,然后使用聚乙二醇(polyethylencglyco,lPEG)把病毒沉淀下来,达到浓缩目的。

水中诺如病毒检测主要步骤包括取样、浓缩富集、检测,其中关键步骤在于浓缩富集。膜过滤法是目前常用的水中病毒富集方法,包括正离子膜^〔14〕、负离子膜^〔15〕、硝酸纤维素膜^〔16〕等。病毒的电荷性特点决定用于富集病毒的正离子膜、负离子膜及硝酸纤维素膜的方法原理各不相同。病毒的电荷性与pH有直接关系。对于大多肠道病毒等电点(PI)通常介于4.8~6.4,因此在pH呈中性的水中,病毒带负电荷;如果pH比等电点高或低的条件下,病毒就会呈现不同的电荷性,从而影响不同膜的使用方法^〔17〕。pH中性的水样本,使用正离子膜富集病毒,无需调节样本的pH,因为此时水样本中病毒带负电荷,能由于电荷的吸附作用被正离子膜吸附富集^〔14〕。pH中性的水样本,使用负离子膜或硝酸纤维素膜富集病毒,必须把水样本的pH调节到足够低,一般为3.0~3.5,并加入一定量的阳离子(如Mg²⁺、Al³⁺等),此时水样本中的病毒带正电荷,能由于电荷的吸附作用被负离子膜或硝酸纤维素膜吸附富集^〔15〕。因此pH是使用不同的膜富集病毒的关键因素,直接影响到膜的富集效果。

几种不同膜在不同实验室进行的实验效果也不尽相同,目前尚无定论哪种膜的病毒富集效果最好。但是正离子膜价格较昂贵,负离子膜在中国国内不容易购得,限制了2者在中国的推广使用。张崇淼等^〔16〕研究发现,硝酸纤维素膜富集效果稳定,病毒回收率较高(>70%),适合不同水样中肠道病毒的浓缩分离。因此从价格、原材料的易于购买、病毒回收率等来看,利用硝酸纤维素膜浓缩富集水中病毒在中国有应用前景。

食品的诺如病毒检测过程主要包括:取样、洗脱病毒、富集病毒、核酸提取、PCR检测或基因芯片检测^〔18〕等。由于食品样本量大、病毒含量低,病毒富集是食品中诺如病毒检测的关键因素。食品成分复杂,富含各种PCR抑制物,PCR抑制物的去除也是食品中诺如病毒检测的重要因素。PEG是具有强烈吸水性及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物,是食品病毒富集的有效方法。PEG由环氧乙烷聚合,是平均分子量为200~20000的乙醇高聚物的总称;其平均分子量不同,性质也不同,可呈无色、无臭、黏稠液体或蜡状固体;毒性随分子量增大而减小,分子量为4000~8000的聚乙醇对人体安全。目前文献报道的用于食品病毒富集的PEG以PEG6000、PEG8000为主,常用终浓度为8%或10%^{〔19, 20〕}。目前尚无定论使用何种浓度及分子量的PEG富集效果最好,而且无论使用何种浓度及分子量的PEG,其富集原理都是在一定pH值下的氨基酸(目前常用甘氨酸洗脱病毒)能够吸附带负电的病毒离子,PEG通过空间位置排斥作用,使液体中的病毒等微粒被迫挤聚在一起而引起沉淀的发生^〔21〕。

食品中病毒检测的另一个关键是,各种复杂的食品成分给PCR带来的抑制而导致检测结果的假阴性。文献报道,氯仿^〔20〕、三氯三氟乙烷^〔22〕、氯仿丁醇^〔23〕、果胶酶^〔24〕等,能除去各种PCR抑制物。目前尚无定论那种物质效果最好。

近年食源性及水源性诺如病毒检测技术得到一定发展。在污染的食品中,贝类由于能从污染的水中富集病毒以及煮熟不彻底,常成为首要的危险食品^〔6〕,被病毒污染的水灌溉的蔬菜及水果也是主要污染食品^〔23〕,市政废水^〔25〕、河水^〔26〕、甚至饮用水也有诺如病毒检出^〔27〕。诺如病毒目前尚不能进行人工培养、病毒基因型复杂多样、食物及水中诺如病毒检测过程复杂、病毒回收率低等都制约了食源性及水源性诺如病毒的进一步研究。因此,应加强病毒人工培养研究,开展更简便灵敏的食源性及水源性诺如病毒检测技术研究,并且在条件成熟时予以标准化,才能更有效预防和处理食源性及水源诺如病毒引起的重大疫情暴发。