中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (9): 1210-1211   PDF    
引用本文
林爱丽, 朱金星, 葛艳芬, 连国军, 曹建明. 血清HDL-C表面活性剂匀相抑制方法建立[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(9): 1210-1211.
血清HDL-C表面活性剂匀相抑制方法建立
林爱丽1, 朱金星2, 葛艳芬2, 连国军2, 曹建明2    
1. 浙江省瑞安市第三人民医院检验科, 温州 325200;
2. 温州医学院环境与公共卫生学院
收稿日期: 2010-03-17.
基金项目: 浙江省科技厅新苗人才计划(2007G60G2090028)
作者简介: 林爱丽(1970- ),女,浙江瑞安人,主管检验师,本科,研究方向:临床生化检验.
通讯作者: 连国军

血清高密度脂蛋白胆固醇的测定是临床常规检验项目,目前其测定方法主要为磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg)和基于选择性抑制原理的匀相抑制法(SI)。PTA-Mg法测定时需沉淀、离心等步骤,无法应用于自动生化分析仪;SI法无需对标本进行特殊处理,操作简便,适合自动分析〔1, 2〕,但测定试剂依赖进口,价格昂贵、检测成本高。本研究参考有关文献〔3, 4〕,建立以三甲基-β-环糊精等表面活性剂为选择性抑制剂的(HDL-C)匀相光度法检测血清。此法在测定过程中无浊度产生,各项方法学指标满足HDL-C的检测要求,适合推广应用。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

UV-2201紫外分光光度计(日本岛津公司);LX-20全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司);HDL-C校准液:混合人血清,反复冻融6次后过滤,在滤液中加入20g/L蔗糖,1mL分装,冻干,复溶后用磷钨酸镁沉淀法定值。HDL-C试剂:试剂I(R1)含80mmol/L3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)-3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸钠(MOPSONa)缓冲液(pH6.5)、2.5KU/L胆固醇氧化酶、5KU/L过氧化物酶、240mmol/L4-氨基安替比林、5g/L三甲基-β-环糊精、10g/L聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物F88、8g/L聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚、稳定剂适量;试剂Ⅱ(R2)含80mmol/LMOPSO-MOPSONa缓冲液(pH6.5)、10g/L环氧乙烷十八烷胺、2KU/L胆固醇酯酶、80mg/LN-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、稳定剂适量。

1.2 自动分析参数

反应类型:两点法;反应温度:37℃;主/次波长:600/700nm;样品:3.L,加R1225μL反应5min后读取空白读数(A1),然后加入R275μL反应5min,读取测定读数(A2)。

1.3 计算

血清HDL-C含量(mmol/L)=〔(∆A)测定管/(∆A)标准管〕×标准液浓度

1.4 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行分析,组间比较采用t检验。

2 结果 2.1 测定波长选择

按本法对标准管、测定管进行显色,以试剂空白作参比,测得标准管、测定管两者络合物最大吸收波长均在596nm处。自动分析仪无596nm波长,故选与之接近的600nm为测定主波长。

2.2 特异性

在一份混合血清(HDL-C为0.97mmol/L)中加入不同量的经超离心提纯的HDL组份,加入量分别为1.4,2.8,4.2,5.6,7.0和8.4mmol/L,然后分别用本法测定。结果表明,8.4mmol/L的LDL-C仅使测定结果偏高3.4%;另取一份HDL-C为1.24mmol/L的混合血清,分别加入脂肪乳剂(TG)、胆红素、血红蛋白,观察HDL-C含量影响。结果表明:TG<10mmol/L、胆红素<280mg/L、血红蛋白<12g/L时对测定结果无影响,提示本法具有良好特异性。

2.3 线性关系

制备HDL-C含量分别为0.81,1.59,2.36,3.13和3.90mmol/L标本,5个不同值标本分别测定10次。结果表明,本法在0~3.90mmol/L范围内线性良好,回归方程为Y=0.979X+0.029,相关系数(r)=0.9997。

2.4 回收率

取HDL-C含量为1.25mmol/L的血清标本分别加入含量为0.75,1.50,2.25mmol/L的HDL-C纯组分进行回收试验。回收率分别为102.6%,98.8%,97.1%,平均回收率为99.5%。

2.5 精密度

取高、中、低3份血清样品,每份均分为12份,按本法测定。测得血清HDL-C平均值分别为0.78,1.32,2.19mmol/L,批内变异系数分别为2.10%,1.44%,0.75%。另取高、中、低3份血清样品连续测定10d,每天2次,测得血清HDL-C平均值分别为0.83,1.46和2.04mmol/L,批间变异系数分别为2.32%,1.67%,1.14%。

2.6 不同方法测定结果比较

取HDL-C含量在0.51~3.23mmol/L的血清标本81份,分别用本法和PTA-Mg法以及日本一化直接测定法同时测定,相关系数(r)分别为0.9896和0.9819,显示本法与PTA-Mg法及日本一化直接测定法相关性良好。

3 讨论

实现HDL-C的匀相直接测定,必须预先将血清中的游离胆固醇清除,否则该部分胆固醇将参与HDL-C的显色反应,使测定结果偏高。本法将胆固醇氧化酶、过氧化物酶及4-氨基安替比林3种组分设置在试剂1(R1)中,将胆固醇酯酶、HDAOS设置在试剂2(R2)中。实验结果表明,3μL血清标本和300μLR1混合并在37℃反应5min后,有12mmol/L的游离胆固醇可以迅速被清除。

能否将LDL-C、VLDL-C、乳糜微粒等非HDL-C组分完全掩蔽是实现血清HDL-C匀相抑制法测定的技术关键。本研究中使用一组特殊的表面活性剂来达到对非HDL-C组分的掩蔽。表面活性剂通常对测定体系有增溶、增敏的作用〔5〕。实验发现,在酶法测定试剂R1中添入5g/L三甲基-β-环糊精、10g/L聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物F88、8g/L聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚,在测定试剂R2中添入10g/L环氧乙烷十八烷胺,便能在生化分析上以两点法的测定方法实现对HDL-C的准确测定,有8.4mmol/L的LDL-C不干扰本法HDL-C的测定。

参考文献
〔1〕 Warnick GR,Nauck M,RifaiN.Evolution of methods formeasurement of HDL cholesterol:from ultracentrifugation to homoge neousassays[J].Clin Chem,2001,47(9):1579-1596.
〔2〕 Nauck M,Warnick GR,Rifai N.Metods for measurement of LDL cholesterol:a critical assessment of direct measurement by homogeneous assays versus calculation[J].Clin Chem,2002,48(2):236-254.
〔3〕 杨昌国,许叶,吕邦太,等.高密度脂蛋白胆固醇的直接测定法[J].临床检验杂志,2000,18(2):73-75.
〔4〕 高德路,张世俊李培瑛.血清高密度脂蛋白胆固醇匀相法测定试剂的研制[J].中华医学检验杂志,1999,22(2):104-108.
〔5〕 潘利琴,陈益川,连国军.血清总铁结合力直接光度法测定[J].中国公共卫生,2008,24(2):246-247.