藤茶多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多种生物活性^〔1〕。目前对多糖的定量测定方法主要有两类。一类是利用多糖的还原性建立的测定方法,另一类是利用多糖在浓硫酸作用下水解生成的糠醛或其衍生物与酚类或胺类化合物缩合生成有特殊颜色物质的这一性质而建立的方法^〔2〕。前一类方法由于多糖的还原性较弱,检测限高而应用较少;后一类方法主要包括蒽酮-硫酸比色法及苯酚-硫酸比色法2种,蒽酮-硫酸比色法用于测定多糖含量时结果偏高,且重现性及稳定性差,苯酚-硫酸比色法灵敏度高,干扰少,重复性好^{〔3, 4〕}。本研究采用苯酚-硫酸比色法建立一种快速、简便的藤茶多糖检测方法,现报告如下。

S53/54型紫外可见分光光度计(上海棱光科学仪器厂);AVANT130型高速冷冻离心机(美国贝克曼有限公司);浓硫酸、苯酚、无水乙醇、丙酮、乙醚、无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司上海分公司)均为分析纯(AR),所有用水均为双蒸水。

于2008年5月中旬在湖北省恩施州来凤县藤茶生产基地采摘藤茶全株叶片。样品置鼓风干燥箱中60℃烘干,粉碎至全部通过80目筛。其他样品制备方法参照文献〔5〕。

对照品(葡萄糖)溶液、藤茶多糖样品溶液与多糖测定方法参照文献〔3〕。按文献〔3〕方法显色后以试剂空白(双蒸水)为参比,在分光光度计上,于400~600nm波长范围进行分别扫描,得2种溶液的吸收光谱相似,并确定最大吸收波长为485nm。精密吸取浓度为100μg/mL的葡萄糖对照品溶液0.05,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL分别置于干燥具塞试管中,各加水补足至1mL,再分别加入1mL9%的苯酚溶液及5mL的浓硫酸,以空白试剂为参比,显色后对6个不同浓度对照品溶液的吸光度进行测定。对线性范围内的葡萄糖质量(μg)和吸光度进行线性回归处理,得曲线回归方程y=93.517x-0.7797,R²=0.998,其中y为质量(μg),x为吸光度。

(1)精密度实验:参照文献〔3〕,对6份浓度为50μg/mL相同的对照品溶液1mL显色后,测定485nm处吸光度,考查该方法的精密度。(2)加标回收实验:精密吸取上述藤茶多糖样品溶液50,75,100,125,150,175μL分别置于干燥具塞试管中,各加入400μL浓度为100μg/mL对照品溶液,并补加水至1mL,再分别加入1mL9%的苯酚溶液及5mL的浓硫酸,以空白试剂为参比,显色后对6个不同浓度的对照品溶液的吸光度进行测定,得多糖含量,计算回收率,考查该方法的准确度。(3)方法的稳定性实验:分别取上述藤茶多糖样品溶液125μL及100μg/mL的对照品溶液400μL置于干燥具塞试管中,并补加水至1mL,再分别加入1mL9%的苯酚溶液及5mL的浓硫酸,以空白试剂为参比,显色后在2h内每隔20min测定1次吸光度,评定该方法的稳定性。

6份相同的对照品溶液经显色后吸光度分别为0.552,0.550,0.548,0.556,0.555,0.552,相对标准偏差(RSD)为0.54%,<5%,表明该方法具有良好的精密度^〔6〕。

6份不同的藤茶多糖样品溶液回收率分别为99.78%,99.53%,100.45%,100.15%,100.20%,99.65%,平均回收率为99.96%,相对标准偏差(RSD)为0.36%,表明该方法具有较好的准确度。

对照品溶液6次测定结果分别为0.438,0.436,0.435,0.436,0.435,0.432,相对标准偏差(RSD)为0.45%,藤茶多糖样品溶液6次测定结果分别为0.392,0.392,0.389,0.390,0.387,0.387,相对标准偏差(RSD)为0.58%,表明该方法的测定结果在2h内稳定性较好。

平行称取2.000g藤茶样品3份测得多糖的质量分数分别为2.79%,2.67%和2.72%,平均为2.73%。

藤茶多糖具有抗肿瘤及免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂等多种生物活性,现已应用于保健及食品工业生产中,因此,对藤茶原料及产品中多糖含量的检测具有重要的现实意义。本研究利用多糖在强酸作用下脱水生成的糠醛或其衍生物能与酚类化合物缩合生成具有特殊颜色的物质这一性质,建立了利用苯酚-硫酸比色法测定藤茶多糖分析方法,并对方法的精密度、加标回收率及稳定性进行了评价。结果表明,该方法吸光度相对标准偏差(RSD)为0.54%,<5%;平均回收率高达99.96%,相对标准偏差(RSD)为0.36%;对照品和样品溶液相对标准偏差(RSD)均<1%。表明该方法准确度高,重复性及稳定性好,可为藤茶及其相关产品质量评价和工业化生产提供参考。