亚甲基蓝(methyleneblue)是一种具有平面结构的碱性生物染色剂,在药学上是一种吩噻嗪类药物,临床上用作亚硝酸盐、氰化物等特效解毒药。亚甲基蓝可通过阻断一氧化氮(NO)来抑制鸟苷酸环化酶,有助于治疗肝肺综合症患者的肺气管扩张^〔1〕,还具有血浆灭活作用^〔2〕。对亚甲基蓝的分析测定有光度法^〔3〕、离子缔合物荧光法^〔4〕、化学发光法^〔5〕等。本实验以离子液体溴化1-丁基-3-甲基咪唑(〔Bmim〕Br)和(NH₄)₂SO₄形成的双水相体系,研究亚甲基蓝的分配性能。这种新体系与传统有机溶剂萃取法比较,具有蒸汽压低、污染及毒性小、简便快速等优点,符合绿色化学要求^〔6〕;与高聚物双水相比较,不易乳化、界面更清晰、离子液体经简单处理可再利用。现报告如下。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);RF-5301PC荧光仪(日本岛津公司);pHS-3D型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)等。离子液体〔Bmim〕Br:按文献〔7〕方法合成;亚甲基蓝(天津天达精细化工厂)溶液:5.0×10^-5mol/L;Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液:pH2.0~12.0;硫酸铵固体。所用试剂均为分析纯,实验用水为二次去离子水。

在15mL刻度比色管中依次加入1.5mL离子液,1.0mL亚甲基蓝溶液,1.0mLB-R缓冲溶液,加水稀释至5.0mL,加入2.0g(NH₄)₂SO₄固体,用力振荡3~5min,摇匀,静置分层。用滴管取出上相,用蒸馏水稀释到5.0mL,摇匀,以不加亚甲基蓝的萃取相作为空白,测定光谱和最大吸收波长处吸光度。

离子液相亚甲基蓝紫外可见及荧光光谱表明,单纯离子液在可见光波长范围内没有吸收(包括荧光),可以作为萃取相而不影响体系的测定;亚甲基蓝在离子液相中的吸光度要明显高于水相,最大吸收波长在668nm处,表明双水相具有富集作用,可提高亚甲基蓝测定的灵敏度;离子液相中的亚甲基蓝在吸收光谱中紫外区最大吸收峰与水溶液中明显不同,荧光强度大于水溶液,且最大吸收波长发生了紫外光移动,说明双水相改变了亚甲基蓝分子结构,离子液与亚甲基蓝发生了作用。以下测定波长选择668nm。

按实验方法,改变(NH₄)₂SO₄加入量。当(NH₄)₂SO₄为1.0g时,体系不分相;加入1.5g时,分相速度慢且萃取不完全;加入2.0~3.0g时分相效果好,萃取完全且吸光度最大;超过3.5g时吸光度减小,原因是盐过量产生盐效应影响亚甲基蓝萃取率。实验中盐用量为2.0g。

固定其他条件不变,加入不同pH值的缓冲溶液1.0mL。结果表明,在pH6~8范围内分相较快,两相界面清晰,吸光度最大。因此,选择pH7的缓冲溶液。

按实验方法,改变离子液用量。当离子液加入量为1.5mL时,分相效果和萃取效果好且吸光度最大,故实验均加入1.5mL离子液。

在20~50℃范围内测定萃取相亚甲基蓝。结果表明,随着温度的逐渐升高,吸光度先略降低再逐渐变高,吸光度变化幅度很小。在室温下将亚甲基蓝萃取相放置不同时间测定吸光度,90min内随着时间的变化,吸光度值变化不大。由此可见,该体系较稳定。

按实验方法,固定相关量,改变亚甲基蓝加入量,结果得线性方程为Y=0.04749+0.68346X,相关系数r=0.9993,线性范围为0.06~1.35μg/mL。

分别在离子液双水相和水溶液中分别加入1.0mL的亚甲基蓝,再分别加入1.0mL浓度为1.0g/L的无机离子、有机物、表面活性剂等共存物质,当相对误差≤5%时,双水相中的以下共存物质K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、NH⁺₄、Al³⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、SO^2-₄、NO₃^-、Cl^-,柠檬酸、水杨酸、尿素、酒石酸钾钠、十二烷基磺酸钠、吐温80、十六烷基三甲基溴化铵等不影响亚甲基蓝的萃取及测定。与水溶液比较抗干扰能力明显提高,其原因是在测定之前进行了萃取分离,使在水溶液中会形成干扰的一些物质被有效分离,从而提高了测定选择性。

表 1

表 1 针剂中亚甲基蓝的测定

表 1 针剂中亚甲基蓝的测定

取同一盒中的亚甲基蓝针剂2支定量转入50mL容量瓶中并用水定容,然后进一步稀释,按实验方法测定,同时加标回收。

在回收的萃取相中加入适量活性炭,加热搅拌溶液变为无色,冷却、过滤。滤液用二氯甲烷萃取,萃取液减压蒸馏,蒸出二氯甲烷和水,即得回收的离子液。将其用于亚甲基蓝萃取分离及光谱测定,结果与原离子液基本相同,说明回收的离子液经简单处理可重复使用。

建立了由简单离子液体〔Bmim〕Br和(NH₄)₂SO₄形成的双水相体系萃取光度法测定亚甲基蓝的新方法。在硫酸铵加入量2.0~3.0g、溶液酸度pH6~8、离子液体用量1.5mL、测定波长668nm时,离子液相中亚甲基蓝有最大吸光度。方法具有简便、灵敏、快速、选择性好的优点,用于针剂亚甲基蓝的测定结果较好。