2010, Vol. 26
2. 福建省厦门市食品科技研发检测中心;
3. 福建省厦门市疾病预防控制中心
近年来,由诺如病毒(Norovirus,NoV)感染接连引起数次感染性腹泻大规模流行,引起相关人士重视〔1, 2〕。为了解福建省厦门市诺如病毒流行状况,探索本地区诺如病毒流行规律和流行因素,为制订防控对策提供依据,本研究于2008年9月-2009年2月在厦门市3所哨点医院进行监测,收集病毒性腹泻患者粪便标本,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时荧光定量PCR法检测标本中诺如病毒。现将结果报告如下。
1 对象与方法 1.1 对象收集2008年9月-2009年2月厦门市第一医院、厦门市妇幼保健院和厦门市第三医院门诊和住院的病毒性腹泻患者143例,其中男性89例,女性54例;城市居民98例,农村居民45例。分别进行流行病学个案调查,同时留取粪便标本1份,10~15g/份,-70℃冻存。
1.2 方法 1.2.1 试剂与仪器RIDASCREEN NorovirusELISA试剂盒(德国R-BiopharmAG公司),QIAampViralRNAMiniKit(德国QIAGEN公司),国产诺瓦克病毒核酸测定试剂盒甲(不分型,深圳太太基因工程有限公司),国产诺瓦克病毒实时荧光定量逆转氯-聚合酶链反应(RT-PCR)检测试剂盒乙(分型,上海之江生物科技有限公司);ABI7500荧光PCR仪(美国ABI公司),SunriseRemote酶标仪(奥地利TECAN公司)。
1.2.2 诺如病毒抗原检测粪便标本解冻后,以标本稀释液作10倍稀释,振荡混匀,静置10min后,室温10000r/min离心5min,取100μL上清液,使用ELISA试剂盒,采用单克隆抗体夹心法,特异性检测GGⅠ和GGⅡ型诺如病毒的共同抗原,按照ELISA试剂盒说明书检测,采用SunriseRemote酶标仪,检测波长为450nm。同时做阴性和阳性对照。
1.2.3 诺如病毒核酸检测(1)核酸提取:粪便标本解冻后,以生理盐水作10倍稀释,振荡混匀,10000r/min离心5min,取140μL上清液,按照QIAampViralRNAMiniKit说明书,以柱离心法提取总RNA,洗脱液为60μL。(2)一步实时荧光定量PCR法检测:采用诺瓦克病毒核酸测定试剂盒甲在ABI7500荧光PCR仪上进行检测。RT-PCR反应体系组份为:NoVPCR反应液14μL,Taq酶液0.5μL,反转录酶液0.5μL,加入样品RNA提取液5μL。反应条件:40℃,逆转录10min;95℃预变性15min;95℃变性15s、60℃60s,共40个循环。
1.2.4 诺如病毒分型采用诺瓦克病毒检测试剂盒乙,在ABI7500荧光PCR仪对上一步检测为NoV阳性样品进行分型检测。反应总体积25μL,其中,NoVI型/Ⅱ型核酸荧光检测混合液19μL,酶液1μL,加入样品RNA提取液5μL。反应条件:40℃,逆转录10min;95℃预变性15min;95℃变性15s、60℃60s,共40个循环。
2 结果 2.1 诺如病毒抗原阳性率143例病毒性腹泻患者中,ELISA法检出诺如病毒抗原阳性45例,阳性率为31.47%;实时荧光定量PCR法检出诺如病毒核酸阳性55例,阳性率为38.46%;阳性样品均为诺如病毒GGⅡ型。抗原与核酸检测均为阳性者37例,占25.87%;抗原或核酸检测任一项阳性者共64例,诺如病毒检出率为44.76%。
2.2 阳性病例分布特点(1)性别分布:采用实时荧光定量PCR法检测诺如病毒核酸阳性的55例中,男性30例,占54.5%,阳性率为20.98%;女性25例,占45.5%,阳性率为17.48%。不同性别阳性率差异无统计学意义(χ2=1.782,P>0.05)。(2)年龄分布(表 1):表 1可见,阳性病例多为20~60岁成年患者,以51~60岁阳性率最高;阳性占总例数比例以21~40岁居多,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)城乡分布:98例城市患者中检出诺如病毒阳性38例,45份农村患者中检出阳性17例,分别占患者总数的26.57%,11.89%,差异无统计学意义(χ2=1.782,P=0.9288)。(4)时间分布(图 1):2008年9月-2009年2月秋冬季节期间,每月均有病毒性腹泻病例,均可检出诺如病毒阳性病例。
 | 表 1 病毒性腹泻患者诺如病毒阳性的年龄分布比较 |
 | 图 1 诺如病毒感染病例时间分布 |
采用ELISA法或实时荧光定量PCR法检测诺如病毒抗原或核酸任一项阳性的64例中,分型确定为诺如病毒GGⅡ型42例,未检出GGI型;仅核酸阳性的55例中,分型确定为诺如病毒GGⅡ型42例;ELISA法检出NoV抗原阳性的45例中,分型确定为诺如病毒GGⅡ型26例;此26例为3种试剂盒一致检出的阳性病例。
3 讨论由诺如病毒(Norovirus,NoV;又名诺瓦克样病毒)引起的感染性腹泻在全世界范围内均有流行,是引起急性胃肠炎暴发的主要病原〔3, 4, 5〕。国内文献也报道了多个地区诺如病毒引起的感染性腹泻暴发疫情的流行病学特点及传播途径〔6, 7, 8〕,高志勇等〔8〕报道北京地区病毒性胃肠炎患者诺如病毒检出率为38.89%,其中97.14%为GGⅡ。诺瓦克样病毒在感染病例粪便标本中数量不定,不同检测方法对检测结果影响较大〔9, 10〕。
本研究结果表明,诺如病毒是引起厦门市急性腹泻的主要病原,各年龄人群均可感染诺如病毒,其中20~60岁患者比例较高;9月和10月的NoV感染率高于其他月份,提示本地区9-10月可能为诺如病毒流行高峰,不同地区流行高峰不一致,可能与中国南北方气候差异有关〔2, 7, 8〕。在预防控制工作中,应加强疫情监测,加强病原学、分子生物学的研究,提高临床诊断和实验室检测能力。目前对NoV引起的感染尚无特殊的治疗方法,应加强饮用水卫生和饮食卫生,加强对公众肠道传染病防治知识的宣传,提倡健康的饮食和良好的个人卫生习惯。
本研究结果表明,143例病毒性腹泻患者中,ELISA法检测粪便标本抗原阳性率为31.47%,实时荧光定量PCR法检测核酸阳性率为38.46%,提示荧光定量PCR可灵敏地检测NoV疑似病例样本,而ELISA的灵敏度偏低,不适合散发病例的实验室检测。
| 〔1〕 | 方肇寅.诺如病毒胃肠炎及其防控对策[J].中华流行病学杂志,2007,28(3):222-223. |
| 〔2〕 | 李海,杨进业.诺如病毒胃肠炎的流行病学研究进展[J].应用预防医学,2008,14(1):55-57. |
| 〔3〕 | Chakravarty S,Hutson AM,Estes MK,et al.Evolution arytrace residues in Noroviruses:importance in receptor binding,an tigenicity,virion assembly,and strain diversity[J].J Virol,2005,79(1):554-568. |
| 〔4〕 | Fankhause R L,Monroe SS,Noel JS,et al.Epidem iological and molecular trends of"Norwalk like viruses"associated with out breaks of gastroen teritis in the United States[J].J Infect Dis,2002,186:1-7. |
| 〔5〕 | Esteve GA,N varro RG,Sala MR,et al.Recom binant Norwalkvir use implicated in gastroen teritisout breaks in Hiroshmia Prefecture[J].J Med Virol,2008,80(5):921-928. |
| 〔6〕 | 陈军林,王滔,高建民,等.福州地区腹泻患者诺瓦克样病毒感染的分子流行病学特点[J].中国人兽共患病杂志,2003,19(2):83-84. |
| 〔7〕 | 戴迎春,刘翼,詹惠春,等.广州市儿童秋冬季诺如病毒感染检测分析[J].中国公共卫生,2009,25(1):102-103. |
| 〔8〕 | 高志勇,严寒秋,罗明,等.北京地区诺如病毒分子生物学特点初步研究[J].中华流行病学杂志,2007,28(7):671-675. |
| 〔9〕 | 唐亚丽.江门儿童、成人腹泻中诺如病毒感染的分子流行病学研究[D].广州:第一军医大学:硕士学位论文,2007. |
| 〔10〕 | 陆冬梅,贾立平,张又,等.医院内诺如病毒感染的三种病原学检测方法应用比较[J].中华流行病学杂志,2007,28(3):218-221. |