镉(cadmium)是一种有毒的重金属元素,美国毒物管理委员会(ATSDR)已将其列为第6位危害人类健康的有毒物质^〔1〕。它在生活环境和作业场所广泛存在,能引起人体及动物多器官和系统损害,半衰期较长。研究显示,镉对雌性哺乳动物的生殖系统具有明显毒性作用^{〔2, 3, 4〕}。本研究采用卵巢颗粒细胞培养体外染毒方法,观察镉对卵巢颗粒细胞凋亡的影响,并进一步探讨其可能作用机制。

22~27日龄健康雌性SD大鼠(南京中医药大学动物实验中心)。层流柜饲养,温度(24±2)℃,湿度60%,普通饲料喂养,自由饮水。

孕马血清促性腺激素(PMSG)(南京创瑞生物试剂公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);Tecnai12型电子显微镜(荷兰Philipus公司);Caspases-3蛋白检测试剂盒(上海碧云天试剂公司)。

大鼠皮下注射PMSG50U/只,48h后处死,摘取双侧卵巢,使颗粒细胞(GC)释放入DMEM-F12的培养液中。1000r/min离心5min,收集细胞,用0.4%的台盼蓝染色,计数活细胞数(应>90%),用培养液调整为2×10⁶/mL的单细胞悬液备用。置5%CO₂、37℃培养箱内培养。加入不同剂量氯化镉,继续培养24h后收集GC及培养液,-20℃冻存,待电镜观察、流式细胞仪检测其凋亡及Caspases-3的表达。

采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法,取颗粒细胞接种于96孔培养板,氯化镉染毒,其终浓度分别为10,20,30和40μmol/L。常规培养24,48h后选择570nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值,重复3次。观察不同浓度氯化镉溶液对颗粒细胞的损伤作用。

加氯化镉40μmol/L作用24h后收集细胞,离心弃上清,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次,加含有Rnase的碘化丙啶(PI)染液避光30min,上流式细胞仪检测。

在卵巢颗粒细胞中加入40μmol/L的氯化镉,24h后收获细胞与上清,上清按说明书顺序加入各种试剂,选择540,405nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值,检测NO、Caspases-3含量。细胞置于戊二醛固定液中,经清洗、固定、脱水等步骤后在透射电镜下观察超微结构。

采用SPSS 11.5统计软件进行分析,组间比较采用t检验。

10,20,30,40μmol/L氯化镉染毒48h,MTT比色吸光度(A)值分别为(0.444±0.027),(0.435±0.017),(0.423±0.016)和(0.417±0.016),与对照组比较,氯化镉对GC具有明显损伤作用,随着氯化镉浓度增加损伤作用加强,存在浓度依赖关系。流式细胞仪检测表明,氯化镉染毒组出现较明显的凋亡现象。

对照组卵巢颗粒细胞培养液上清中NO浓度为(5.52±0.30)μmol/L,氯化镉染毒组细胞上清中NO浓度降至(4.04±0.42)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。

对照组Caspases-3蛋白浓度为(72.55±1.70)μmol/L,氯化镉染毒组Caspases-3蛋白的表达升高至(82.14±3.45)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。

对照组颗粒细胞的超微结构未见明显破坏,细胞核和细胞基质密度均匀。氯化镉染毒组颗粒细胞的超微结构与对照组比较有明显差异,可见细胞膜发泡现象内质网增生肥大、肿胀扩张,呈空泡状改变,分泌颗粒明显减少,细胞核内染色体发生移位、边集等。

新生儿卵巢中约含有40多万个卵泡,妇女在绝经前,不间断的卵泡发育展示了一种选择性的生理性细胞死亡过程,大多数卵泡最终消失,仅有不到1%的卵泡发育成熟,排卵。许多研究表明颗粒细胞凋亡触发了卵泡闭锁。本研究结果显示,氯化镉明显损伤了卵巢颗粒细胞。氯化镉作用后细胞的超微结构发生了明显变化,可见细胞膜发泡现象,分泌颗粒明显减少表明GC分泌E₂的功能减弱。NO是一种具有多种生物学潜能的局部调节分子,在卵泡发育过程中具有重要作用,NO浓度随卵泡发育出现波动^〔5〕。本研究结果显示,氯化镉组细胞上清中NO水平明显升高(P<0.05),表明NO参与卵巢颗粒细胞的凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一,在细胞凋亡的执行阶段,负责对全部或部分关键性蛋白的酶切(激活或灭活)。结果显示,Caspase-3蛋白在染毒组表达明显高于对照组(P<0.05),表明卵巢颗粒细胞的凋亡与Caspases-3高表达有关。