研究表明,低剂量铅明显抑制海马以及海马神经元神经细胞粘附分子(NCAM)的表达,并造成其表达时程上的延迟^{〔1, 2〕}。而NCAM有多种亚型,其中有3个主要亚型分别为NCAM120、NCAM140和NCAM180,其结构和生理功能均有差异。本研究旨在探讨低剂量铅对这3个主要亚型表达影响,进一步了解铅的神经毒性及其作用机制。

神经母细胞株(SH-SY5Y)(中山大学中山医学院药理学教研室);DMEM培养基(高糖)(美国Invitrogen公司);免疫组化试剂盒(武汉博士德公司);NCAM单克隆抗体(美国Sigma公司);NCAM多克隆抗体(美国Santacruz公司);二抗(美国ProteintechGroup公司);T4空质粒及NCAM180-T4、NCAM140-T4、NCAM120-T4重组质粒(香港科技大学);EclipseTi-e型倒置相差显微镜(日本Nikon公司);垂直电泳与转移系统(美国Bio-rad公司)。

SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清、1%青-链霉素DMEM培养基,37℃、5%CO₂、相对湿度95%的恒温培养箱中常规培养。染毒时,预先配好各浓度的PbCl₂溶液,按2.5%的比例加入到无血清DMEM培养基中,使PbCl₂终浓度分别为0,0.2,1,5,25μmol/L,分别处理24,48h。用台盼蓝法测定细胞存活率(计数500个细胞)。

种植细胞于6孔板中,按说明书进行转染操作。使用免疫组织化学法和蛋白印迹(Westernblot)法进行NCAM转染后鉴定,按试剂盒说明书进行操作。

(1)对转染后的细胞按方法1.2进行染毒,氯化铅终浓度为1,10μmol/L。另设阴性对照,无血清DMEM培养基中加入等比例去离子水。(2)蛋白提取与定量:按说明书进行蛋白提取操作,-80℃保存。用Bradford法^〔3〕进行蛋白定量。(3)Westernblot测定:灌7%分离胶和5%浓缩胶,蛋白上样量为40μg,55V跑至浓缩胶和分离胶交界处,90V继续电泳直至溴酚蓝染料刚跑出分离胶底端;转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;4℃封闭10~12h;一抗4℃孵育10~12h,含0.1%吐温-20的Tris盐缓冲溶液(TBST)洗10min×3次;二抗室温孵育1h,曝光显影,定影。重复实验3次。

用ScanGear软件扫描后,用QuantityOne软件测定条带的平均吸光度,求出NCAM条带的平均吸光度与相应内参(β-tubulin)的平均吸光度比值。

表 1

表 1 PbCl2染毒后SH-SY5Y细胞的死亡数与存活率

表 1 PbCl2染毒后SH-SY5Y细胞的死亡数与存活率

PbCl₂染毒后SH-SY5Y细胞的死亡数与存活率随着铅浓度的增加和染毒时间的延长逐渐下降;并且随着染毒时间的增加,铅影响细胞存活率的剂量-反应关系更为明显。

表 2

表 2 铅对NCAM3个亚型表达影响(x ± s)

表 2 铅对NCAM3个亚型表达影响(x ± s)

用1,10μmol/L氯化铅分别染毒24,48h后,与阴性对照比较,NCAM120和NCAM180的表达均降低;而NCAM140在10μmol/L剂量染毒24h时表达降低,差异有统计学意义。

铅可影响NCAM的表达^{〔4, 5, 6〕};而NCAM各亚型在神经系统中的作用不完全相同。本研究结果表明,0~25μmol/LPbCl₂均不引起细胞急性毒性。以1,10μmol/L作为染毒剂量,在3个NCAM主要亚型中,NCAM120表达受铅的影响最大。NCAM120在神经系统中主要分布在神经胶质细胞。在结构上与NCAM180和NCAM140相比,只有膜外区域而没有跨膜区域和膜内区域。铅使NCAM120表达降低,可能会降低胶质细胞与神经元之间结合的稳定性。此外,在少突胶质细胞中,NCAM120与Fyn激酶活性有关^〔7〕,而这2者在髓鞘形成的早期可能发挥重要作用。铅是否通过对NCAM120表达的影响来破坏神经元轴突的髓鞘形成过程,可用胶质细胞作进一步的研究。此外,研究发现,母鼠的铅染毒可使仔鼠出生前、后NCAM转录水平降低^〔5〕,与铅影响NCAM3个亚型表达有关。由于NCAM各亚型均由单一基因编码,不同亚型是经不同剪切方式得到,而铅是否影响剪切过程尚需进一步研究。