人工蛹虫草子实体是采用天然蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.er.Fr.)Link]中分离的拟青霉经人工培养所获得的子实体,其化学成分与天然虫草相似^〔1〕,为麦角菌科虫草属植物蛹虫草。近年来随着人们对人工蛹虫草子实体功效作用和药用价值的关注,各类以人工蛹虫草子实体为主要原料的产品不断涌现,其食用人群也逐年扩大。作为一种新的食用和药用资源,其食用安全性也越来越受到社会重视。2009年3月,对人工蛹虫草子实体醇提物致突变的可能性及其在遗传毒性方面的潜在影响进行了实验研究。结果报告如下。

SPF级NIH种小鼠(广东省医学实验动物中心)100只,雌雄各半,体重25~30g,动物生产许可证号:SCXK(粤)2008-0002,颗粒饲料由广东省医学实验动物中心提供。室温(22±2)℃,湿度60%~80%。

全自动扫描显微镜(德国蔡式公司);中国地鼠肺(CHL)细胞株(上海细胞库);人工蛹虫草子实体醇提物(珠海先康生物有限公司);环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)、丝裂霉素C(mitomycin,MMC)(美国Sigma公司);秋水仙素(colchicine,COL)(上海化工试剂厂),分析纯。

小鼠50只,雌雄各半,按体重随机分为5组:醇提物高(10.00g/kg)、中(5.00g/kg)、低剂量组(2.50g/kg)、对照组(纯净水)和CP组〔40mg/(kg·bw)〕。采用30h法进行实验,灌胃量为0.2mL/10g体重,第2次染毒后6h处死小鼠取胸骨骨髓制片、染色。每只小鼠观察1000个嗜多染红细胞,计数嗜多染红细胞微核率。

小鼠25只,雄性,按体重随机分为5组:醇提物高(10.00g/kg)、中(5.00g/kg)、低剂量组(2.50g/kg)、对照组(纯净水)和CP组〔40mg/(kg·bw)〕。每天灌胃1次,连续灌胃5d,灌胃量均为0.2mL/10g体重,首次染毒后第35天处死动物,取双侧副睾按常规制片、染色。每只小鼠观察1000条完整精子,计算精子畸形发生率。

在加和不加代谢活化系统(S₉)条件下,分别设醇提物2500,1250,625,312和156μg/mL组、阴性对照组和阳性对照组(CP120μg/mL,MMC1.6μg/mL)。将CHL细胞接种于6孔培养板中,接种密度为1×10⁶/孔,在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h后,加入不同浓度受试物及不含血清的培养液,代谢活化组同时加入S₉,放在培养箱中作用2h后,加入含10%新生小牛血清的培养液,继续培养24h。于收获前4h加入秋水仙素,终浓度为1.0μg/mL,按常规方法消化,低渗,固定,制片,Giemsa染色。每组选取100个中期分裂相细胞,并计算染色体畸变率。

在加与不加代谢活化系统条件下,共设5个醇提物剂量组,分别为5000,1000,200,40,8μg/皿,同时设自发回变、溶剂对照和阳性对照组。采用平板掺入法,在顶层培养基中加入0.1mL试验菌株增菌液,0.1mL受试物溶液和0.5mLS₉,混匀后倒入底层培养基平板上,每个剂量组均为3个皿。置37℃下培养48h。用平板计数仪观察记录各试验组每皿回变菌落数。

采用SPSS10.0软件进行分析,组间比较采用Poisson分布和χ²检验进行。

表 1

表 1 人工蛹虫草子实体醇提物小鼠遗传及生殖毒性实验结果

表 1 人工蛹虫草子实体醇提物小鼠遗传及生殖毒性实验结果

各剂量组小鼠骨髓细胞微核形成率、精子畸形率无明显增加(P>0.05);用156~2500μg/mL人工蛹虫草子实体醇提物处理的CHL细胞染色体畸变率亦无明显升高。提示人工蛹虫草子实体醇提物无体细胞致突变作用,对体内生殖细胞无致突变作用。

在加与不加S₉时,5个剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照菌落数2倍,也未出现明显的剂量反应关系;阳性对照组回复突变率与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。检测结果表明,在本研究条件下未发现人工蛹虫草子实体醇提物有增加鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株回复突变的作用。

遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定,以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤,一般被认为是遗传效应的基础,故遗传毒性试验主要用于致癌性预测^{〔2, 3〕}。多倍体在体外染色体畸变试验常见,如果在体外试验中可见多倍体,而非结构上的染色体断裂,体内微核试验阴性,通常表明缺乏诱导非整倍体证据^{〔4, 5, 6〕}。由于遗传毒性试验容易出现假阳性和假阴性结果,因此对结果进行综合分析尤为重要,如果体外与体内试验的结果不一致,应进一步分析原因,如化合物在体内可能发生的代谢、分布、排泄差异等等。本研究采取体内与体外相结合的研究方法,避免了单一结果所产生的偏差。结果表明人工蛹虫草子实体醇提物无致突变作用及遗传毒性。

中药产业是中国具有资源优势和知识优势的传统产业,人工蛹虫草子实体作为新的药用资源在新药研究方面具有较高应用价值,适于推广。