全球每年70%的腹泻病例与各种致病性微生物污染食品有关^〔1〕。目前多数企业采用具有抑菌作用的合成食品添加剂添加到食品中,以期待达到防腐效果。但是合成添加剂对人体有一定的毒副作用,近年来,人们倾向于选择安全性高的天然食品防腐剂^〔2〕。狼毒是一种具有抗肿瘤抗菌及免疫调节等药理作用的中草药。研究表明,狼毒根丙酮提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等8种食源性细菌有较强的抑制活性^〔3〕。本研究于2009年采用狼毒根不同溶剂提取物对4种不同食源性病原菌的抑制作用进行观察,为食品防腐研究提供科学依据。

干燥狼毒根(四川中医药研究所)。供试食源性致病菌大肠埃希菌(E.coli)、沙门菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)(河南科技大学医学院微生物研究室)。

9101型旋风式微型高速样品粉碎机(北京检测仪器有限公司);RE-52B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义英峪仪器厂);SW-CJ-1F型单人双面超净工作台(苏州净化设备有限公司);6×10mm牛津杯(北京先驱威锋技术开发公司);20分度游标卡尺(深圳伟创精密仪器有限公司);95%乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、吐温-80等均为分析纯(西安化学试剂厂)。

准确称取5份狼毒根干燥粉,每份20g,分别置于旋转蒸发仪的蒸发甁中,用120mL的水、95%乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯于60℃水浴加热条件下浸提0.5h,过滤得到浸提液,对滤渣进行复提;再次过滤,弃去滤渣,合并2次滤液于旋转蒸发仪内减压浓缩为浸膏。再向含有浓缩浸膏的蒸发瓶中加入适量10%乙醇,以浓度为1%吐温-80助溶,然后于旋涡混合器上将不同溶剂的提取浸膏振荡洗脱下来,转入10mL棕色容量瓶中并用0.85%生理盐水定容,制成含生药量为2.0g/mL的狼毒原液,用前用生理盐水稀释成狼毒生药含量分别为2.0,1.0,0.5,0.25,0.125g/mL。

采用牛津小杯扩散法^〔4〕对狼毒根提取物的抑菌效应进行分析。用微量移液器分别吸取不同菌株的菌悬液[浓度为10⁶~10⁸集落生成单位(CFU)/mL]100μL注入平板内,用无菌涂布棒涂布均匀,静置15min使菌液渗入培养基,制成含菌平板。用灭菌镊子夹取无菌牛津杯平放于含菌平板上,每板上间隔一定距离放置6管。然后,用已灭菌滴管吸取药液加满牛津杯,每个浓度的药液做3个平行样,阴性对照设浓度为10%乙醇和0.85%生理盐水2个组;37℃恒温培养箱中培养24h,游标卡尺测量抑菌圈,计算平均值。凡抑菌圈直径>10mm者为强抑菌活性,用+++表示;抑菌圈直径为8~10mm的为中等抑菌活性,用++表示;抑菌圈直径为7~8mm者为弱抑菌活性,用+表示;抑菌圈直径<7mm用“-”表示,无抑菌活性^〔5〕。

表 1

表 1 浓度为2.0,1.0g/mL提取物的抑菌圈直径 ( x ± s, mm)

表 1 浓度为2.0,1.0g/mL提取物的抑菌圈直径 ( x ± s, mm)

由表 1可见,浓度为2.0g/mL不同溶剂狼毒根提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、志贺菌均有强抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌抑菌效果最强;仅生理盐水和丙酮狼毒根提取物对沙门菌表现强抑菌活性。浓度为1.0g/mL不同溶剂狼毒根提取物对金黄色葡萄球菌仍有强的抑菌活性外,仅见到生理盐水、丙酮相应提取物对大肠埃希菌和志贺菌有强抑菌活性;除丙酮狼毒根提取物对沙门菌有弱的抑菌效果外,其余溶剂提取物对沙门菌无抑菌活性。

结果表明,药物浓度为0.5g/mL不同溶剂狼毒根提取物对金黄色葡萄球菌均有强抑菌活性,抑菌圈直径在3~19mm,对沙门菌等几种细菌有弱抑菌活性或无抑菌活性;当药物浓度为0.25和0.125g/mL时,不同溶剂对应提取物对金黄色葡萄球菌均有中等抑菌活性,对沙门菌等几种细菌均无抑菌效果。

本研究结果表明,各种提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,各种提取物在较高浓度时,才对革兰氏阴性菌表现出抑制作用。狼毒提取物对4种指示菌的抑制效果由强到弱依次为:金黄色葡萄球菌>志贺菌>大肠埃希菌>沙门菌。研究报导,狼毒对动物源性无乳链球菌也有较强的抑制作用^〔3〕。但狼毒根不同溶剂提取物对革兰阳性菌抑制作用是否大于革兰阴性菌有待进一步研究。

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒和医院院内感染的重要病原菌,亦是最易产生耐药性的致病菌之一。从本研究结果来看,狼毒丙酮提取物对金黄色葡萄球菌的抑制活性最强,有望用于食品的抑菌防腐,研发出新的天然食品防腐剂^{〔6, 7〕}。狼毒根丙酮提取物对金黄色葡萄球菌有强抑制活性,但由于提取物成分极其复杂^{〔8, 9, 10〕},起抑菌作用的可能是某单一成分,也可能是几种成分共同作用的结果。因此,要确定何种成分抑菌活性最好及其抑菌机制,还有待进一步研究。