重金属铅作为神经毒物普遍存在,具有很强的神经亲和性,铅暴露可导致儿童智力缺陷及学习记忆认知能力异常,但其机制仍在探讨之中^〔1〕。中枢神经细胞信号转导过程中相关蛋白激酶功能的改变是目前铅神经毒作用机制研究中的重要内容之一。本研究于2009年使用Ca²⁺/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的激活剂、抑制剂、及铅对大鼠海马脑片进行处理,通过检测CaMKⅡ的下游信号分子环腺苷酸(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)的活性及表达总量来进一步探明急性染铅对Ca²⁺-CaMKⅡ信号转导通路的影响。

出生30dWistar大鼠(中国医科大学实验动物中心),性别不限,24只。

醋酸铅(沈阳化学试剂厂),兔抗磷酸化及非磷酸化CREB多克隆抗体(上海Promega公司),辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗(北京中山生物技术有限公司),AlphaInnotechCorporation5500型自动凝胶成像分析系统及ChemiImager5500V203(美国自然基因有限公司)。

参照文献〔3〕制备海马脑片。(1)急性染铅对CREB活性影响实验:分为对照组和染铅组,染铅组用含20μmol/L醋酸铅的人工脑脊液(ACSF)灌流。分别于0,3,75,15,30,60,120min收集脑片,对照组以不含醋酸铅的ACSF灌流并与染铅组同一时段收集脑片。四甲基偶氮噻唑蓝法鉴定脑片存活状况。(2)谷氨酸、CaMKⅡ特异性抑制剂(KN-93)、铅对CREB活性影响实验:分对照组(培养液为普通ACSF液)、谷氨酸组(谷氨酸5μmol/L)、KN-93组(KN-932μmol/L^〔3〕)、谷氨酸+醋酸铅组(谷氨酸5μmol/L,醋酸铅20μmol/L),培养30min后收集脑片。检测下游信号分子CREB的磷酸化活性及总量表达。

用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质,通过电转移槽转移至硝酸纤维素膜。立春红染液染膜,确定分子量并进行标记。将膜分别加入相应一抗和二抗进行孵育。于暗室中加入发光试剂,曝光。蛋白印迹显影图扫描,利用图像分析软件对实验结果进行分析,灰度值代表酶含量,以对照组酶含量为100。

用SPSS 11.5软件进行方差分析。P﹤0.05差异有统计学意义。

表 1

表 1 急性染铅对大鼠海马CREB活性的影响 (x ± s, n= 3)

表 1 急性染铅对大鼠海马CREB活性的影响 (x ± s, n= 3)

染铅组CREB活性随染铅时间延长而明显降低,对照组CREB活性无明显变化。

图 1

注: 1: 对照; 2: 谷氨酸; 3: KN-93; 4: 谷氨酸 + 醋酸铅。 图 1 谷氨酸、KN-93、铅对CREB活性影响

谷氨酸使磷酸化的CREB活性增强47%,对非磷酸化的CREB表达无明显影响;KN-93通过抑制CaMKⅡ活性使CREB活性降低20%,对总量CREB表达无显影响;铅可拮抗谷氨酸的作用,使谷氨酸引起CREB活性降低45%,对总量CREB表达无明显影响。

研究认为,在学习记忆中,一些蛋白激酶被磷酸化而激活参与学习记忆过程。其中CaMKⅡ在脑组织中高度表达是突触后颗粒的主要成分,突触激活产生的钙离子内流激活Ca²⁺+/CaM敏感的腺苷酸环化酶(adenylatecyclate,AC),催化三磷酸腺苷(ATP)合成cAMP,通过一系列反应最后可激活被CREB调控的基因,完成新蛋白的合成。在此过程中,cAMP和转录因子CREB在长期记忆中起关键作用;而铅在无Ca²⁺+存在下也可作用于钙调素^〔4〕,进而影响CaMKⅡ的活性,抑制谷氨酸引起CaMKⅡ的活性增强,长时程增强(LTP)的产生^〔5〕。因此认为该酶的活性改变可能是铅导致学习记忆损害的原因之一^〔6〕。

本研究结果表明,铅可能通过改变CaMKⅡ活性,降低下游信号分子CREB的磷酸化水平,干扰基因表达和新蛋白质的合成,导致学习记忆功能损伤,表明CaMKⅡ在铅中毒导致学习记忆损伤中起重要作用。