半夏泻心汤由半夏、黄芩、干姜、人参、炙甘草、黄连、大枣七味中药组成。以往研究表明,半夏泻心汤具有明显的调节胃肠运动作用^{〔1, 2〕}。但对其作用机制方面的研究相对不足,特别是半夏泻心汤作用与胃平滑肌离子通道电流的关系报道较少,为探讨半夏泻心汤调节胃肠运动作用靶点,深入研究其作用机制,本实验用急性分离的豚鼠胃窦环行肌细胞和膜片钳等技术,观察半夏泻心汤含药血清对豚鼠胃窦环行肌细胞膜电位与毒蕈碱受体门控电流的影响。现将结果报告如下。

卡巴胆碱与G蛋白抑制剂(美国Sig-ma公司)。膜片钳放大器(德国HEKAInstrument公司,EPC10),显微操纵仪(美国SISKIYOUSESIGNInstrument公司,MX7600R型)。膜片钳电极拉制仪(日本Narishige科学仪器公司,PP-83型),纯水器(Milli-QPlus系统,法国Mil-lipore公司),数显恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司,HT100-4型)。

采用EWG/B豚鼠,雌雄不拘,体重在300~350g。用木棍击头后,迅速剪取胃窦部放入氧饱和无钙磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗,然后分离环行肌并将其分割成肌条(1×4mm)。将肌条放入装有36℃消化液的试管中进行孵育。消化液是由0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.1%的二硫苏醇糖、0.15%的胰蛋白抑制剂和0.2%的牛血清白蛋白溶入4mL无钙的PBS缓冲液组成。孵育结束,用管口圆滑的滴管轻轻吹打肌条得到分离的单细胞。取1滴细胞悬浮液(0.1mL)平铺于倒置显微镜镜台上的灌流槽底部,待10~15min细胞沉降至槽底后,用8-通道灌流系统进行灌流(2~3mL/min)。然后用电阻为2~5MΩ的玻璃电极进行5~10GΩ的千兆封接。膜电位钳制在-20mV,全细胞电流是通过EPC-10型膜片钳放大器记录。

半夏泻心汤含半夏55.78g、黄芩、干姜、人参、炙甘草各46.86g、黄连15.63g、大枣42.00g组成,生药剂量根据文献〔7〕换算,依照人单位体重生药量求得豚鼠单位体重生药量,扩大10倍;以蒸馏水煎煮30min,提取2次。再合并煎液,双层纱布过滤,水浴浓缩为1g/mL冰箱中备用。每日给药2次,连续给药3d,给药体积均为1mL/100g,末次给药1h后,采血并分离血清,经灭活、过滤后冻存备用。

采用SPSS 12.0软件进行t检验。

图 1

注: 与给药前相比, aP < 0.01。 图 1 半夏泻心汤含药血清对胃窦平滑肌细胞去极化作用

细胞旁给予0.2mL的半夏泻心汤含药血清时膜电位发生去极化,由-60.0mV去极化至(-49.7±3.0)mV,去极化后的膜电位绝对值与静息电位相比减少了10.3%(P<0.01)。

在常规全细胞模式下,膜电位钳制在-20.0mV,用氯化铯代替细胞外的氯化钠和电极内液的氯化钾阻断钾通道以后,毒蕈碱电流可被Carbachol(50μmol/L)诱导出来。当用15%半夏泻心汤含药血清灌流时I_cch增加(73.91±9.42)%。

图 2

注: 与给药前相比, a P < 0.01; 与半夏泻心汤血清相比, b P < 0.01。 图 2 G蛋白抑制剂阻断半夏泻心汤含药血清增强毒蕈碱电流作用

在上述相同条件下记录毒蕈碱电流,用半夏泻心汤含药血清处理,当15%半夏泻心汤含药血清先增加毒蕈碱电流以后,细胞旁给予0.2mmol/LGDP_βS,半夏泻心汤含药血清增加毒蕈碱电流幅度由原来(73.91±9.42)%降低到(24.82±7.79)%,增强幅度明显降低(_P<0.01)。

半夏泻心汤已经广泛运用于治疗胃肠运动功能性疾病,疗效显著^{〔3, 4, 5〕}。细胞膜电位是衡量细胞兴奋性的一个基本指标,本实验首先观察了半夏泻心汤含药血清对平滑肌细胞膜电位的影响,结果提示半夏泻心汤含药血清有提高胃平滑肌细胞兴奋性作用。另一方面,由于胃肠道平滑肌运动主要受胃肠激素和神经递质调节^〔6〕,本实验用carbachol(50μmol/L)诱导出毒蕈碱电流,当细胞旁给予半夏泻心汤含药血清时电流明显增强,当细胞外液用含半夏泻心汤含药血清灌流同时给予G蛋白抑制剂时,半夏泻心汤含药血清增加电流幅度明显降低,提示半夏泻心汤含药血清调节胃肠作用与胆碱能系统有关,G蛋白参与了半夏泻心汤含药血清增强毒蕈碱电流效应。

综上所述,半夏泻心汤含药血清可以通过使平滑肌细胞膜电位去极化,提高细胞兴奋性,另一方面能过G蛋白介导,增加胆碱能系统引起的毒蕈碱电流,实现对胃肠运动的调节作用,但具体作用机制以及细胞内信号传导过程,还需进一步深入研究。