2010, Vol. 26
, 杨三平 氟虽是机体必须微量元素之一,但长期过量摄入易导致氟中毒。肾脏是机体主要排氟器官,进入机体的氟约有85%经肾脏排出。同时肾脏也是氟损害的敏感靶器官之一〔1〕,大鼠长期饮用高氟溶液可使肾脏组织产生明显的病理学形态和功能改变〔2〕。迄今为止,有关氟对机体损伤的机理尚无定论,氟中毒的氧自由基学说比较公认,而核因子ΚB(NF-ΚB)是氧化应激调节的靶因子之一。研究表明,氟暴露会引起幼鼠脑海马神经元内NF-ΚB表达水平升高〔3〕,以往对于氟致肾脏毒性研究多以急性、亚慢性为主。本实验拟通过测定不同氟浓度下雄性大鼠肾脏的氧化损伤水平,结合NF-ΚB表达水平变化,探讨慢性氟中毒致肾脏损伤的机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器4%多聚甲醛固定液(武汉博士德生物公司);谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、总蛋白定量测试盒(南京建成生物工程研究所);免疫组织化学(SABC)试剂盒(北京中杉公司);NF-ΚB亚单位多克隆抗体(美国SantaCruz公司)。全波长酶标仪(美国Thermo公司);5471R高速离心机(德国Eppendorf公司)。
1.2 实验动物与染毒选用ICR品系雄性大鼠(浙江省实验动物饲养中心)120只,体重为70~90g,适应7d后,随机分成4组,每组30只。对照组饮用自来水含氟量<0.1mg/L,低、中、高氟组分别饮用15,30,60mg/L的氟化钠溶液。染毒时间为9个月,实验期间动物自由饮水、进食标准饲料(含氟量<0.2mg/kg)。
1.3 一般状况观察染毒结束后,每组随机选取10只大鼠,称体重后,断头处死,剥离肾脏称重,按脏器系数=脏器重(g)/体重(100g),计算肾脏脏器系数。并取部分大鼠肾脏组织置于4%中性多聚甲醛液浸泡固定,梯度脱水,常规石蜡包埋,制成4μm厚石蜡切片。常规脱蜡,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察肾脏组织的肾小球等形态结构。
1.4 抗氧化酶活力和脂质过氧化产物测定每组随机选取大鼠8只,将大鼠肾脏剥离被膜,称重后剪碎,按照质量/体积比为1：9的生理盐水在4℃下制成匀浆,3000r/min离心10min,取上清液,按照试剂盒说明测定GSH-Px、SOD、MDA、T-AOC活性及蛋白质含量。
1.5 肾脏NF-ΚB表达检测余下每组12只大鼠用于NF-ΚB检测用SABC试剂盒,按其说明书进行操作,一抗选择兔抗大鼠NF-ΚB亚单位多克隆抗体;采用Image-ProPlus图像分析系统,将每个肾脏组织切片在高倍镜下(400×)下观察并拍照,在照片上准确选择特定颜色区域,并用软件计算出其吸光度值(A)。
1.6 统计分析所有实验数据采用SPSS 18.0软件包进行分析,采用t检验和相关回归分析进行处理。
2 结 果 2.1 慢性氟中毒对大鼠体重及肾脏脏器系数影响染毒9个月后,中、高氟组大鼠氟斑牙症状明显。对照、低、中、高氟组大鼠体重分别为(714.07±61.21),(693.86±56.95),(692.71±76.20),(638.53±49.35)g,各组大鼠体重呈下降趋势,高氟组体重较对照组明显降低(P<0.05)。对照、低、中、高氟组大鼠肾脏脏器系数随着染毒剂量增加,呈上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 氟染毒对大鼠肾脏组织形态结构影响 (图 1) | 注: A: 对照组; B: 低氟组; C: 中氟组; D: 高氟组。 图 1 慢性氟中毒对大鼠肾脏组织形态结构影响 (HE, 400×) |
中、高氟组较对照组核染色加深,细胞间隙明显加大。高氟组与对照组比较,肾小球皱缩,与基底膜断裂,并伴有节段性坏死。随着染氟剂量增加,氟对肾脏组织的损伤程度逐渐加深。
2.3 大鼠肾脏抗氧化酶活性及 MDA含量 (表 1) | 表 1 慢性氟中毒对大鼠肾脏抗氧化酶活性影响 (x ± s, n = 8) |
与对照组比较,各染毒组大鼠肾脏GSH-Px活性均升高;T-AOC无明显变化;SOD活性有下降趋势;低、高氟组MDA含量均明显上升(P<0.05)。
2.4 氟中毒对大鼠肾脏 NF-ΚB 表达水平影响对照、低、中、高氟组阳性细胞的吸光度值分别为(0.136±0.024),(0.147±0.018),(0.163±0.019)和(0.178±0.019),随着染毒剂量加大,各染氟组NF-ΚB的表达水平呈线性上升趋势,高氟组NF-ΚB的表达水平明显高于对照组(P<0.05)。
3 讨 论本研究结果表明,慢性氟中毒可致机体内抗氧化酶活性下降,进一步验证了氟中毒自由基损伤学说〔4〕。各染氟组GSH-Px活性未呈现规律性变化,与对照组比较,呈上升趋势,这可能是机体内一种代偿性氧化反应,值得进一步研究。NF-ΚB是一种重要转录因子。当细胞受到自由基、细胞因子等刺激时,可激活NF-ΚB进入细胞核内,参与基因转录调控。许多免疫炎症相关因子含有NF-ΚB的结合位点〔5, 6〕。研究表明,细胞内NF-ΚB表达异常是脑细胞受损〔7, 8〕、肿瘤发生〔9〕、炎性疾病的产生〔10〕等潜在因素之一。本研究结果表明,随着染氟剂量增加,机体氧化作用的增强,大鼠肾脏内NF-ΚB表达变化呈现上升趋势,提示,肾脏组织内NF-ΚB对氟暴露较敏感。推测慢性氟中毒致肾脏损伤的机理可能是:机体摄入过量氟后,其抗氧化酶活性降低,自由基增多,引起肾脏组织内NF-ΚB表达异常,从而引发肾脏组织内免疫炎症反应,破坏原生质的结构与功能,引起肾结构改变,降低肾小管功能,最终损伤肾脏。
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